一文读懂 | 液体试剂的四种除氧流程，适用于严格厌氧菌的小规模培养

引言

厌氧菌培养的核心，在于严格排除氧分子（空气氧和液体溶解氧），并根据菌种的苛刻程度，提供适配的低氧化还原电位环境。

针对四种不同设备条件和经费预算的方案，详细阐述操作流程、参数设定与注意事项。

所有操作建议配合刃天青指示剂（终浓度 1 mg/L）使用，培养基因呈无色或无氧状态为合格，粉红色则指示有氧。

# 往期回顾：

《厌氧微生物培养关键实验器材与操作体系综述》，访问链接： https://www.huizaobio.com/article/a472.html

《厌氧微生物培养基的配制原理与技术》，访问链接： https://www.huizaobio.com/article/a471.html

《厌氧菌培养技术指南》德国微生物保藏中心DSMZ：从原理到实操，访问链接： https://www.huizaobio.com/article/a336.html

《亨盖特厌氧滚管技术（Hungate Anaerobic Roll-Tube Technique）：原理、操作与应用指南》，访问链接： https://www.huizaobio.com/article/a371.html

《碎肉碳水化合物肉汤培养基(DSMZ Medium 110，CMC)的组分及其配置要点》，访问链接： https://www.huizaobio.com/article/a318.html

方案一、厌氧手套箱（厌氧工作站）法

适用场景：经费充裕，有长期、大批量厌氧菌操作需求的研究团队。

1. 厌氧手套箱（厌氧工作站）法的设备与耗材

厌氧手套箱：选择知名品牌，如，Shell-Lab、Coy、Don Whitley等。

手套箱主体为密闭操作舱，配有转移过渡舱（传递仓）、手套操作口、催化剂系统、气体控制系统。

Shell-Lab 厌氧手套箱

工作气体：高纯混合气（通常 N₂∶CO₂∶H₂ = 85∶10∶5 或 80∶10∶10 等），H₂用于与钯催化反应除残留氧，维持箱内微正压。

指示剂：培养基中添加刃天青。

还原剂：L-半胱氨酸盐酸盐、Na₂S 等，用于加速液体除氧。

辅助工具：无菌培养皿、移液器及吸头、接种环、酒精灯（禁止在箱内使用明火，可用红外电热灭菌器）、记号笔等。

# 所有物品提前灭菌，不耐热材料，用 70% 酒精擦拭后，从过渡舱传入。

2. 厌氧手套箱（厌氧工作站）法的操作流程

(1) 准备工作

提前 2 小时开启手套箱循环，确认水、氧探头显示达标（O₂ < 5 ppm，厌氧要求苛刻时 < 1 ppm）。

催化剂使用一段时间后效率下降。每隔1-2周，于烘箱中160°C加热2-4小时干燥。

配制好的培养基、稀释液等敞口放入过渡舱，执行“抽真空-充氮”循环至少 3 次后，移入主箱体。

(2) 培养基/试剂除氧

在箱体内打开瓶盖，将液体静置过夜，使溶解氧自然逸散，并被系统循环去除。

加速方法：每升培养基，添加 0.5 g L-半胱氨酸盐酸盐，或 0.2 g Na₂S·9H₂O（预先配成除菌过滤液，平衡 pH 至 7.0 左右），轻摇溶解。

除氧完成后，盖紧瓶盖移出箱体；

(3) 接种与培养

打开菌种原管，用移液器，或无菌吸管，吸取菌悬液，接种于已除氧培养基。

若倾倒平板，需使用预还原培养基，在箱内使用。

可选用透气封口的容器，直接在箱内培养，或密封的亨特管/西林瓶，置于普通培养箱培养。

箱内培养期间，需持续运行维持厌氧。

手套箱使用效果

# 手套箱使用注意事项

使用前检查手套，有无针孔或老化龟裂，定期更换。

减少大幅移动操作，避免反复拉伸，造成袖口松动渗入空气。

新装或长时间未使用的箱体，放入培养基后，观察刃天青指示剂颜色，确认环境无氧。

平板在箱内培养时，避免冷凝水滴落。

方案二、真空泵 + 惰性气瓶联合除氧法（双排管系统）

通过阀门切换，可以方便地切换真空和惰性气体，适用对空气和水敏感的无水无氧反应（也称Schlenk line 系统），常用于有机化学试验。

适用场景：有机械泵和气体钢瓶，需要灵活控制气体组分，厌氧要求高，但无手套箱。

系统结构：

管路1：气瓶→减压阀→管路→双排管→针头接口；

管路2：真空泵→冷阱→缓冲瓶（可选）→管路→双排管。

真空气体分配双排管系统

1. 真空泵 + 惰性气瓶联合除氧法（双排管系统）的系统搭建

双排管气路：一端经冷阱（防倒吸）连接旋片式真空泵，另一端连接高纯惰性气体钢瓶，如，高纯氮气或按需配 N₂/CO₂ 混合气，亦可另接 H₂/CO₂ 钢瓶供给特殊菌群。

每个歧管接口配双通阀，切换“抽真空”或“充气”。

连接件：厚壁真空橡胶管、 0.22 μm 针头过滤器、不锈钢长针头（出气用）和短针头（进气用）。

气体：高纯氮（≥99.999%）。对需要CO₂的菌株，预先混配N₂/CO₂（如80:20 v/v）；某些菌需少量H₂，配置需谨慎。所有管路使用前检漏。

真空泵：选用耐化学腐蚀隔膜泵或油泵。

2. 双排管系统的材料与容器

厌氧亨特管：带丁基橡胶塞和螺旋盖，可耐受反复穿刺；

西林瓶/血清瓶：压盖式铝盖配丁基橡胶塞；

取样瓶：配专用硅胶塞，不能用普通塞；

注射器（1–20 mL）；

密封检验：抽真空，关闭阀观察10分钟不变；或充气至0.05 MPa正压，浸入水中检漏。

3. 双排管系统的操作流程

(1) 空容器除氧

取洁净干燥的亨特管或西林瓶，插入连接双排管的无菌针头，开启阀门至真空泵端，抽真空至 –0.08 ~ –0.09 MPa 并维持 1 min。

切换阀门充入惰性气体至轻微正压（瓶塞稍鼓起）。重复“抽-充”循环 3 次，使顶空为无氧环境，保持正压备用。若是压盖瓶可立即用封口钳压紧铝盖。

(2) 培养基制备与分装

在三角瓶中按配方配制培养基，加热煮沸 1–2 min 以驱除大部分溶解氧，冷却至 50°C 左右。

高温变性、受热易分解和相互反应的组分必须单独配制、除菌，并在厌氧条件下合并，如：

维生素（B₁₂、生物素、叶酸等）：配成 100× 浓缩液，0.22 μm 滤器过滤除菌，4°C 厌氧保存。

碳酸氢钠（产甲烷菌、某些瘤胃菌 CO₂ 来源）：配成 8% (w/v) 溶液，过滤除菌，不可加热。

糖与氨基酸（葡萄糖与某些氨基酸高温易发生美拉德反应）：葡萄糖配制为 20% 溶液，115°C 单独灭菌 15 min 或过滤除菌。

半胱氨酸、硫化物：配成 5% 溶液，调 pH 至中性后过滤除菌。因半胱氨酸盐酸盐使 pH 下降，需提前用 NaOH 调至 6.8–7.2 再除菌。

在惰性气流保护下（或用双排管在容器口形成气帘），将基础培养基分装至已除氧的亨特管或西林瓶中，装液量不超过总体积的 50–60%。

需单独配制的热敏/反应性组分示例表：

# 培养基基础灭菌后，在无菌厌氧条件下（手套箱内或通过双排管通气），用无菌注射器分别注入过滤除菌的原液，摇匀。在惰性气体保护下快速完成。

(3) 液培除氧（抽换气）

向每瓶加入适量已除菌的还原剂母液（终浓度如 0.05% L-半胱氨酸盐酸盐，0.025% Na₂S），立即塞好胶塞但不压铝盖。

将容器重新连至双排管，抽真空至液体开始轻微起泡（约 –0.06 MPa 即可，避免暴沸），维持 30–60 秒，切换充入无氧气体到正压。

观察刃天青指示剂（0.5-1 mg/L）变为无色后，再多循环1次。最后一次循环后充气至正压0.03-0.05 MPa，便于接种。

循环参数示例：

最后一次充气后使瓶内维持微正压，迅速压紧铝盖或旋紧瓶塞。

(4) 灭菌

将密封好的容器置于高压灭菌锅中，121°C 灭菌 15–20 min（或 115°C 相应延长）。由于瓶内有正压，需确保容器耐压、胶塞固定良好。

灭菌冷却后，对极严格厌氧菌，在接种前，用无菌注射器，补充少量还原剂。

(5) 接种

待培养基冷却至适宜温度，使用无氧无菌注射器吸取种子液0.5-1 mL；

瓶口胶塞消毒，针头穿刺注入，轻摇混匀。

若培养需摇床，应确保压盖牢固，防止脱落。

4. 注意事项

抽真空时，注意液体沸腾状态，可在真空管路上加装放气阀缓慢调节。

分离的各组分（维生素、碳酸氢盐等）必须在灭菌冷却后、接种前，于无氧条件下通过注射器注入。

真空泵前须加装冷阱和干燥塔，防止水蒸气、培养基组分吸入泵油。

# 补充信息

市面上也有公司，基于真空和置换原理，开发了专用于液体除氧的设备，主体结构由一台真空泵，外接一瓶惰性气体组成，如下：

液体除氧设备（抽真空+气体置换）

方案三、惰性气瓶单气路置换除氧法

去掉真空泵，通入惰性气体冲洗置换空气，配合煮沸和还原剂除去溶解氧。

适用场景：缺少真空泵，利用惰性气体，吹扫置换。

1. 置换除氧法的原理

用高纯惰性气体（N₂ 或 N₂/CO₂ 混合气）持续通入液体培养基，将空气和溶解氧，从排气口驱出，再密封灭菌，最后加入还原剂，进一步降低氧化还原电位。

2. 置换除氧法用到的耗材

高纯氮气钢瓶、减压阀、气体流量计、0.22 μm 针式滤器、长进气针头、短排气针头、耐压西林瓶/亨特管、带胶塞。

3. 置换除氧法操作流程

培养基煮沸驱氧：

培养基煮沸10-15 min后，分装至西林瓶或亨特管等，插入长针头直达瓶底，插入另一短针头作为排气口。

长针头通入惰性气体，流速约每秒2-3个气泡，冷却通气30-45分钟。

添加还原剂：从短针头注射器加入还原剂。

终止通气：通气结束时，先拔短针再拔长针，立即压紧铝盖或旋紧螺盖，使容器内保持微正压。

灭菌与接种：将密封的培养基高压灭菌。灭菌后通过注射器，加入过滤除菌的还原剂和热敏添加剂，摇匀后刃天青变为无色，备用接种。

Hungate 技术中无菌通气针的组装（A：用于对开启容器进行无菌无氧气体置换的通气针；B：使用无菌气体混合物对厌氧培养物进行增压）

4. 置换除氧法的注意事项

气体须经 0.22 μm 过滤除菌，钢瓶气体含水量过高时，可串联干燥管。

排气针尽量远离液面，防止液体喷溅堵塞。

置换效率受液量和温度影响，建议在刃天青不变色后，再多通 10 min 确保效果。

若无明显褪色，可延长通气时间，或添加少量还原剂。

方案四、小体积容器装满 + 还原剂除氧法

利用小容积容器（5-10 mL），尽量装满培养基，挤出空气，只保留接种空间。配合注射器，添加还原剂，除去残留溶氧。

适用场景：预算有限，常规厌氧菌（非严格厌氧）的培养，仅需“注射器+还原剂”，即可完成。

1. 小体积容器装满 + 还原剂除氧法的原理

将液体培养基，尽量充满容器。再利用注射器，穿塞注入还原剂，去除溶解氧。

所有添加、接种操作，均通过穿刺胶塞完成，避免接触空气。

2. 小体积容器装满 + 还原剂除氧法的耗材准备

容器：带有丁基橡胶塞的厌氧管，如Hungate 型试管，或带有硅胶内塞的螺旋口试管。

注射器：1 mL、2 mL、5 mL 无菌注射器及针头。

还原剂：预先配置无菌的 L-半胱氨酸盐酸盐（5%，pH 7.0）或 Na₂S·9H₂O（2.5%，pH 7.5–8.0），分装备用，厌氧避光保存，必要时，可负20℃冻存。

适用于严格厌氧菌培养的容器（A：Hungate管：带螺帽和丁基橡胶隔垫；B：Balch管：带丁基橡胶塞和用于固定塞子的铝盖卷边密封，密封容器需使用卷边器，图片由 Bellco glass 提供）

3. 小体积容器装满 + 还原剂除氧法的操作流程

(1) 配制与分装

按配方配制基础培养基，煮沸除氧，若含热敏成分则分开准备。

将培养基尽量充满厌氧管，拧紧螺盖。

若使用铝盖亨特管，可同样做法，装满后压紧。此步骤在超净台或生物安全柜内操作。

(2) 还原剂添加

用 1 mL 注射器，吸取还原剂母液，穿塞注射（例如终浓度 0.05% 半胱氨酸，即每 10 mL 培养基注射 0.1 mL 母液）。拔出针头后立即用酒精棉按压针孔片刻。

轻轻颠倒混匀，观察刃天青颜色。

(3) 灭菌

将管放入高压灭菌锅，121°C 灭菌 15–20 min。

因液体装满，加热时膨胀压力很大，必须使用耐压管，并确保胶塞牢靠；螺口管稍拧松半圈灭菌，灭菌后趁热拧紧。

(4) 接种与添加热敏组分

所有操作，均通过注射器穿刺胶塞：待培养基冷却后，注入维生素、碳酸氢钠等无菌原液。

接种时，用注射器将菌液从种菌管中抽出，立即转接到目标管，同样穿刺注射，混匀后置适宜温度培养。

Hungate 管无氧取样示意图（穿刺隔垫，注入与后续取样体积等量的无氧气体至瓶内（防止形成负压）；随后倒置培养瓶，吸取所需量液体；最后小心移出针头及注满液体的注射器）

4.小体积容器装满 + 还原剂除氧法的注意事项

此法除氧能力，依赖还原剂，难以彻底除去培养基中的氧气。因此，极度严格的厌氧菌（如某些产甲烷古菌、厌氧硝化菌），建议采用方案二或三来培养。

还原剂母液的 pH ，须提前调整好：半胱氨酸盐酸盐溶液酸性强，会拉低培养基缓冲性，应用无菌 NaOH 调至 6.8–7.0 再过滤。Na₂S 溶液呈碱性，也需调至 pH 7.5 左右，避免局部 pH 剧变。

因管内空气体积较少，承压空间小，受热膨胀易造成塞子弹出。灭菌前务必确认胶塞固定。

穿刺胶塞操作，避免同一位置反复，以降低漏氧风险，可使用有多个穿刺位点或更换新塞。

还原剂与指示剂的通用指南

常用氧指示剂：刃天青

储存液：刃天青钠盐，配制0.1%（w/v）水溶液，过滤除菌，4°C避光保存。

工作浓度：培养基中添加终浓度1 mg/L（每升加0.1%储存液1 mL）。

颜色反应：氧化态呈蓝色至粉红色，还原态无色。培养基灭菌后应为无色，若显粉红色表明溶氧未除尽。

还原剂推荐配方

对挑剔厌氧菌的强化还原策略

组合还原剂：半胱氨酸+硫化钠+Ti(III)柠檬酸盐。

适当提高浓度，但避免毒性。

全程在手套箱内，或严格维持正压的厌氧管中操作。

注射器操作细节

预置无氧注射器

选用带鲁尔锁的无菌一次性注射器（1-20 mL）

使用前，吸排高纯氮气3-5次，排尽针筒内空气

穿刺胶塞标准手法

用70%酒精棉片，擦拭胶塞顶部，并待干。

将针头以30-45°角斜刺入，斜面朝上旋转推进，避免直刺造成胶塞芯落入瓶中。

针尖穿透后轻扶针筒稳定。推注液体缓慢均匀，避免急速推入产生气泡。

拔出针头前，可先略回抽少许气体，使针尖处液体回退，拔针后用酒精棉按压片刻。

避免回弹带入空气

培养瓶内若为正压，用小指勾住芯杆，或选用带锁止注射器。

若为负压，接种前培养瓶应保持微正压。

转移大体积液体可采用双针头平衡压力法：一个针头注入菌液，另一针头插入无菌滤器排气。

换针技巧

每穿刺不同瓶应换新无菌针头，防止交叉污染。

更换针头时迅速操作，可在氮气流保护下，或使用无菌三通阀切换。

常用的厌氧培养基和厌氧辅助耗材采购目录

其他通用细节与安全提示

气体纯度要求

真空泵安全使用与防倒吸

泵前必须串联冷阱和缓冲瓶。停泵前务必先关闭与系统相连的阀门，然后对泵口放空泄压，最后关泵，防止泵油倒吸。

每周检查泵油状态，及时更换。

容器密封性检验

正压法：充气至0.05 MPa，浸入水中看气泡。

负压法：抽至-0.08 MPa，关闭阀观察10分钟，下降小于0.005 MPa为合格。

指示剂法：除氧后装入刃天青液体，过夜不变色则密封与除氧合格。

煮沸除氧时间参考

常压下煮沸10 min可去除绝大部分溶解氧。

500 mL以上体积建议延长至15-20 min。

煮沸后尽快冷却并通惰性气体，防止回吸氧。

灭菌后沉淀或分层处理

磷酸盐沉淀：降低钙镁浓度，或使用过滤除菌的磷酸盐母液后加入。

硫化物沉淀：减少金属离子或硫化钠浓度。

分层或浑浊：灭菌后摇匀，可考虑加入少量琼脂（0.05%-0.1%）作为稳定剂。

操作失败常见原因排查

指示剂变粉红/蓝：密封漏气、抽换气不充分、还原剂失效或浓度不足、手套箱钯催化剂失效。

菌株不长或生长极差：还原剂抑制、pH不适、需添加特殊生长因子、温度错误、接种量过小。

灭菌后瓶内负压：灭菌时气体热胀冷缩或漏气，需重新充正压。

污染：注射器或针头未无菌、胶塞多次穿刺后破损、滤器失效。

摇床培养时塞子飞出：瓶内正压过高，用胶带加固或改用可锁瓶盖。

真空抽不下去：系统漏气，用检漏液检查各接口。

基于以上四种方案，可在不同硬件条件下，有效实现厌氧菌的培养。根据菌种的严格度、实验室设备与经济预算灵活选用。

参考文献

厌氧微生物滚管分离技术  http://ruyangmicrobio.org/anaerobic-rolltube

DSMZ Medium 579 地杆菌培养基配置 https://mediadive.dsmz.de/medium/579?ccno=DSM%2012127

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更新日期：2025-12-20

编制人：小藻

审稿人：小藻