厌氧微生物培养基的配制原理与技术
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：37 发布时间：2026-03-21 15:08:22
引言
在厌氧微生物学研究中，培养基的配制是，决定实验成败的关键步骤。其核心在于创造，并维持一个严格的厌氧环境，以支持那些对氧气敏感的微生物的生长。
本文系统介绍了从无氧水制备到，最终培养基配制的完整流程，并引用了经典的Widdel营养液配方。
液体培养基
1. 无氧水的制备：厌氧操作的基础
无氧水是配制所有厌氧试剂和培养基的基石。
其制备旨在彻底移除溶解氧，标准操作流程如下：
1. 煮沸除氧：取100 mL去离子水于洁净烧杯中，加热并维持沸腾约15分钟，以驱除大量溶解氧。
2. 热转移与容器准备：预先向一个120 mL的厌氧瓶（如血清瓶）中通入高纯度氮气，以置换瓶内空气。随后，趁热将约50 mL煮沸后的水迅速倒入瓶中，并立即用丁基橡胶塞密封。
3. 换气除氧：
o 推荐方法（真空-换气法）：使用真空泵与氮气钢瓶，对密封的厌氧瓶进行“抽真空 → 充氮气”循环，重复至少3次，以最大限度地置换残留的氧气。
o 替代方法（持续吹扫法）：若无真空装置，可在步骤2的热转移过程中或灭菌后，通过注射器针头向瓶内液面上方持续通入氮气15分钟，随后密封。
4. 灭菌与储存：将制备好的无氧水进行常规高压蒸汽灭菌（121°C，20分钟）。灭菌后，建议在冷却过程中再次短暂通入氮气以平衡瓶内压力，随后用铝盖密封，于室温或4°C避光储存备用。
2. 无氧化学溶液的配制策略
配制含有特定化学物质的无氧溶液时，需根据其热稳定性选择相应策略：
• 耐高温化学品：
可直接将精确称量的化学品置于厌氧瓶中，再按上述无氧水制备方法（煮沸除氧、热转移、换气、灭菌）进行配制与灭菌。
• 不耐高温化学品：
需在厌氧手套箱（Atmosphere Controlled Glove Box）内进行操作。先将化学品称量并转移入手套箱，再将其溶解于事先配制好并已转移入手套箱的无氧水中。
混合均匀后，使用0.22 μm孔径的针头式滤器进行过滤除菌。
3. 厌氧微生物生长因子：Widdel营养液配方
许多厌氧微生物的生长依赖特定的维生素和微量元素。
Widdel和Bak在其关于硫酸盐还原菌的经典论述中，提出了一套被广泛引用的营养液配方。
以下是其主要组成：
• 非螯合微量元素混合液 (Nonchelated trace element mixture)
o 基础液：100 mM HCl
o 组分 (终浓度)：FeSO₄ 7.5 mM, H₃BO₃ 0.5 mM, MnCl₂ 0.5 mM, CoCl₂ 0.8 mM, NiCl₂ 0.1 mM, CuCl₂ 0.01 mM, ZnSO₄ 0.5 mM, Na₂MoO₄ 0.15 mM。
• 硒酸盐-钨酸盐溶液 (Selenite-Tungstate solution)
o 基础液：10 mM NaOH
o 组分：Na₂SeO₃ 0.02 mM, Na₂WO₄ 0.02 mM。
• 维生素混合液 (Vitamin mixture)
o 基础液：10 mM磷酸钠缓冲液 (pH 7.1) 100 mL
o 组分：4-氨基苯甲酸 4 mg， D(+)-生物素 1 mg， 烟酸 10 mg， 钙D(+)-泛酸盐 5 mg， 吡哆醇二盐酸盐 15 mg。
• 硫胺素溶液 (Thiamine solution)
o 基础液：25 mM磷酸钠缓冲液 (pH 3.4) 100 mL
o 组分：盐酸硫胺素 10 mg。
• 维生素B₁₂溶液 (Vitamin B12 solution)
o 基础液：去离子水 100 mL
o 组分：氰钴胺 5 mg。
上述各溶液的配制均应遵循第2部分的无氧溶液配制原则，优先保证维生素和微量元素的生物活性。
| 序号 | 英文原文 | 中文翻译 |
|---|---|---|
| 1. | Nonchelated trace element mixture (Widdel et al., 1983) | 非螯合微量元素混合液（Widdel 等，1983） |
| Distilled water | 蒸馏水 | |
| HCl (25 % = 7.7 M) | 盐酸（25% = 7.7 M） | |
| FeSO₄·7H₂O | 七水合硫酸亚铁 | |
| H₃BO₃ | 硼酸 | |
| MnCl₂·4H₂O | 四水合氯化锰 | |
| CoCl₂·6H₂O | 六水合氯化钴 | |
| NiCl₂·6H₂O | 六水合氯化镍 | |
| CuCl₂ | 氯化铜 | |
| ZnSO₄·7H₂O | 七水合硫酸锌 | |
| Na₂MoO₄·2H₂O | 二水合钼酸钠 | |
| The trace element mixture is autoclaved in bottles tightly closed with rubber-fit screw caps or fixed stoppers; a head space of approx. ⅓ of the volume must be left (air for common use; N₂ for strictly anoxic procedures). | 微量元素混合液装入瓶中，用橡胶密封螺帽或固定塞子紧密封闭后进行高压灭菌；瓶内需保留约三分之一体积的顶空（常规使用空气；严格厌氧操作时使用氮气）。 | |
| 4. | Selenite-tungstate solution | 亚硒酸盐-钨酸盐溶液 |
| Distilled water | 蒸馏水 | |
| NaOH | 氢氧化钠 | |
| Na₂SeO₃·5H₂O | 五水合亚硒酸钠 | |
| The solution is autoclaved as described for solution 1. A slight turbidity and flocs may be formed by reaction of the alkaline solution with the glass surface, but the solution is still useful. | 溶液按上述第1种溶液的方法进行高压灭菌。碱性溶液可能与玻璃表面反应产生轻微浑浊和絮状物，但溶液仍可使用。 | |
| 6. | Vitamin mixture | 维生素混合液 |
| Sodium phosphate buffer (10 mM; pH 7.1) | 磷酸钠缓冲液（10 mM；pH 7.1） | |
| 4-Aminobenzoic acid | 对氨基苯甲酸 | |
| D-(+)-Biotin | D-(+)-生物素 | |
| Nicotinic acid | 烟酸 | |
| Calcium D-(+)-pantothenate | D-(+)-泛酸钙 | |
| Pyridoxine dihydrochloride | 盐酸吡哆醇 | |
| The solution is filter-sterilized (pore size, 0.2 μm). The solution is kept at 4°C in the dark, preferably in bottles of brown glass. For strictly anoxic procedures, the solution may be kept under N₂ as described later for phenol solution (solution 17). | 溶液经滤膜灭菌（孔径0.2 μm）。储存于4°C避光处，最好使用棕色玻璃瓶。对于严格厌氧操作，可参照酚溶液（溶液17）所述方法，在氮气保护下保存。 | |
| 7. | Thiamine solution | 硫胺素溶液 |
| 10 mg thiamine chloride dihydrochloride dissolved in 100 ml of 25 mM sodium phosphate buffer, pH 3.4. The solution is filter-sterilized and stored as described for solution 5. | 将10 mg硫胺素盐酸盐溶于100 mL pH 3.4的25 mM磷酸钠缓冲液中。溶液经滤膜灭菌，并按溶液5所述方法储存。 | |
| 8. | Vitamin B₁₂ solution | 维生素B₁₂溶液 |
| 5 mg cyanocobalamine dissolved in 100 ml distilled water. The solution is filter-sterilized and stored as described for solution 5. | 将5 mg氰钴胺溶于100 mL蒸馏水中。溶液经滤膜灭菌，并按溶液5所述方法储存。 |
4. 复合厌氧培养基的构建与应用实例
以配制一种通用的基础盐培养基为例，展示如何集成上述组分，并针对不同生理类群的厌氧微生物进行定制。
4.1 基础培养基配制
1. 配制含有以下成分的混合液：0.58 mM K₂HPO₄, 0.42 mM KH₂PO₄, 0.1 mM NH₄Cl。此为基础盐溶液。
2. 将基础盐溶液按第1部分方法制成无氧溶液并灭菌，冷却至室温。
3. 分别配制高浓度的无菌无氧母液：NaHCO₃ (如1 M) 和 CaCl₂ (如25 mM)。
4. 在无菌厌氧条件下，将NaHCO₃和CaCl₂母液加入冷却的基础盐溶液中，使其终浓度分别为10 mM和0.25 mM。
5. 按终体积百分比加入Widdel营养液：0.1% (v/v) 非螯合微量元素混合液，0.05% (v/v) 硒酸盐-钨酸盐溶液，0.1% (v/v) 维生素混合液，0.1% (v/v) 硫胺素溶液，0.1% (v/v) 维生素B₁₂溶液。此即“厌氧基础培养基”。
4.2 针对特定菌群的培养基定制
在厌氧基础培养基中，无菌加入相应的碳源、电子供体、电子受体等无氧母液，即可得到专用培养基。
| 目标微生物生理类群 | 碳源/电子供体 (终浓度) | 电子受体 (终浓度) | 其他关键添加剂 (终浓度) |
|---|---|---|---|
| 硝酸盐还原菌 | 乳酸钠 (20 mM) | NaNO₃ (20 mM) | — |
| 发酵型细菌 | 乳酸钠 (20 mM) | 无 (发酵代谢) | 半胱氨酸盐酸盐 (2.5 mM， 作为还原剂)， 酵母提取物 (0.5 g/L) |
| 硫酸盐还原菌 | 乳酸钠 (20 mM) | Na₂SO₄ (20 mM) | 半胱氨酸盐酸盐 (2.5 mM， 作为还原剂)， 酵母提取物 (0.5 g/L) |
5. 重要注意事项
1. 全程厌氧：自无氧水制备开始，所有涉及试剂转移、分装、接种的操作，均需在严格的厌氧条件下进行，可使用厌氧工作站或Hungate滚管技术。
2. 配方验证：本文提供的配方，特别是基础盐和Widdel营养液浓度，源于经典文献。在实际研究中，必须根据所培养的具体微生物物种的最新文献，或相关数据库信息进行验证和优化。
3. 组分灵活调整：基础培养基的盐分组成、碳源与电子供/受体的种类和浓度，需根据目标微生物的生态来源（如淡水、海洋、高温环境）和代谢特性进行相应调整。
总结
本文系统阐述了厌氧微生物培养基的配制原理与标准化操作流程，核心在于通过物理与化学方法彻底去除氧气，并全程维持厌氧环境。
全文遵循严格的科研逻辑，首先详述了无氧水与无氧溶液的两种制备策略（煮沸-换气法与手套箱操作法），为所有试剂配制奠定了基础。
继而，重点介绍了厌氧微生物生长所必需的维生素与微量元素补充剂，系统引用了经典的Widdel营养液配方，包括其具体成分与缓冲体系。
最后，文章整合上述组件，演示了如何构建复合厌氧基础培养基，并以硝酸盐还原菌、发酵菌和硫酸盐还原菌为例，通过表格清晰展示了如何通过添加特定的碳源、电子受体与还原剂来定制适用于不同生理类群的专用培养基。全文强调，所有操作均须在严格厌氧条件下进行，且培养基配方需根据具体研究对象进行验证与优化，为相关研究提供了具有高参考价值的技术指南。
参考文献
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更新日期：2026-03-15
编制人：小灰
审稿人：小藻