厌氧菌液到货处理，含转接与甘油冻存操作流程

上一篇专栏，我们介绍了4种制备液体培养基除氧的操作流程：

《一文读懂 | 液体试剂的四种除氧流程，适用于严格厌氧菌的小规模培养》访问链接： https://www.huizaobio.com/article/a549.html

熟练这些液体除氧操作的步骤，难免需要时间学习。

为提高大家对产品的了解，并在收到产品后，能够尽快妥善处理和保存。

本文对厌氧菌产品的，发货形式 和 到货处理步骤，做简单介绍（原本也不难！）。

# 若您厌氧菌培养经验丰富，或 实验室厌氧条件充分，请忽略本操作步骤说明，按实验室常规流程处理即可。

一、产品与物料准备

到货产品

收到的物品已做无菌处理，且维持厌氧状态：

菌液：1支，12 mL亨特玻璃管，含10 mL左右活性菌液，浓度10^7-10^9cfu/ml。管口为硅胶内塞+顶空内螺旋盖，可多次穿刺。

# 厌氧玻璃试管呈放的菌悬液，菌量更大，对于运输和使用，也较为方便。因此，我们发货的厌氧菌形式，主要以菌液为主，仅少数菌株，无合适液培，发甘油冻存管（干冰运输） 或 平板菌形式。

即用型液培：2支，同规格亨特管，各含10 mL左右预还原液体培养基。

菌液和培养基中，均添加有刃天青作为氧化还原指示剂，处于还原态时呈无色，漏氧时呈粉红色。

管内气相：均为80% N₂/10% H₂/10% CO₂，胶塞密封。

厌氧菌液和即用型空培，澄清管委即用型空培，浑浊管为菌液

双层厌氧封装，食品级真空塑封 + 内螺旋厌氧玻璃管（也称亨特管）

# 安全提示

试管预充的厌氧混合气为：80% 氮气 + 10% 氢气 + 10% 二氧化碳。

操作区保持通风良好，避免氢气积聚。

推荐在生物安全柜、超净工作台，或消毒通风橱中，使用75%酒精擦拭表面除菌。

严禁将预充气体，暴露在酒精灯等明火附近，以及可能产生电火花的设备。

自备耗材

无菌注射器：1~2 mL规格

冻存管：1.5-2.0mL/支

75%酒精棉

50%预除氧无菌甘油：推荐使用预制成品，灌装于可穿刺亨特管中，并预还原除氧除菌。

还原剂：如，L-半胱氨酸盐酸盐溶液

试管架、马克笔、无菌手套等常规耗材。

可将接种注射器，插入惰性气体的出气口，抽吸换气3–5次，置换注射器中的残留氧。

没有惰性气体的同学，可以省略这一步，或替换为依靠还原剂，中和残余氧。

二、刃天青指示剂与还原剂

刃天青：有氧状态，呈粉红色或蓝紫色；氧气被消耗后，厌氧状态下，转变为无色（还原态）。

通过观察指示剂颜色，可判断操作过程中，是否意外引入氧气。

还原剂：辅助清除残余溶解氧，维持低氧化还原电位。

常用还原剂为L-半胱氨酸盐酸盐或九水硫化钠等，以下是常见还原剂表：

当刃天青显示粉色时，可加入适量还原剂，恢复培养基的厌氧状态。

三、厌氧菌转接培养

操作前检查

取出菌液管和空培管，观察外观有无破裂。戴上手套，用75%酒精棉擦拭双手和操作台面。

刃天青颜色检查：在光线充足处，观察培养基颜色。

正常状态：指示剂应为无色，呈现培养基本来的颜色，如RCM无色透明，CMC黄色透明。

氧化状态：若液体泛粉红色，先用还原剂处理。

厌氧包装示意图

接种步骤

1. 标记：取1支即用型液培，标注内容、日期。

2. 消毒胶塞：用酒精棉，擦拭菌液和空培管，晾干。

3. 安装排气针（可选，非必须项）：取1支无菌注射器，保留针头作为排气针，垂直刺入空培管胶塞，确保针尖处于管内气相。

4. 吸取菌液：取第2支注射器，先抽1~2次润滑，刺入菌液管缓慢吸取菌液：接种量按5%~10%计，培养基装量10 mL，吸取0.5~1.0 mL菌液。拔针前可回抽少许气体平衡压力。

5. 接种空培：将带菌注射器刺入空培管，缓慢推注菌液，完成后先拔出排气针，再迅速拔出接种针头。

6. 轻柔混匀：将空培管轻轻旋转或颠倒2~3次，使菌液均匀分散，避免剧烈振荡。

7. 培养：将已接种的空培，放入适宜温度的培养箱。

生长观察和记录

厌氧菌的培养条件，应根据菌种特性优化，一般包括以下参数：

温度：大多数临床和环境中分离的厌氧菌最适生长温度为35-37℃。某些嗜冷厌氧菌可能需要较低温度（20-30℃），而嗜热厌氧菌可能需要更高温度（50-60℃）。

时间：厌氧菌通常生长较慢，需要24-72小时的培养时间，有些甚至需要更长时间（5-7天）才能可见明显生长。

气体条件：严格厌氧菌需要O₂浓度低于0.5%，甚至低于0.01%；兼性厌氧菌对氧耐受性较强。多数厌氧菌需要一定浓度的CO₂（5-10%）以促进生长。

定期观察菌株生长情况，根据实验目的记录：

液培：观察浑浊度、气体产生、沉淀物形成、颜色变化等。

固培：观察菌落形态（大小、形状、颜色、边缘、隆起等）、溶血现象、产色素等。

镜检：如革兰染色，观察菌体形态、排列和染色特性。

基因测序：细菌取样，送16S rRNA测序。

记录观察结果，包括培养时间、温度、生长情况、异常现象等，这些记录对于优化培养条件和问题排查非常重要。

漏氧补救

若收到时空培漏氧，或操作中带入氧气，可用还原剂补救。

我司预制的还原剂溶液：每10 ml培养基，加入0.1~0.2 ml。

加入还原剂后，轻轻混匀静置，待颜色转为无色后，再接种。

若自行配制还原剂，采用0.22 μm滤膜除菌，不推荐高温高压灭菌。

四、甘油冻存

当培养物生长至对数中后期，菌液明显浑浊，通常24~72小时，即可制备甘油冻存管。

准备工作

将厌氧无菌50%甘油管平衡至室温。若甘油管中添加了刃天青，应确保无色；

标记菌名、日期、批次；

消毒双手和工作台面。

甘油菌悬液制备

1. 用酒精棉擦拭培养好的菌液管胶塞，及厌氧甘油管胶塞。

2. 取无菌注射器，刺入甘油管，抽取与菌液等体积的50%甘油。

3. 迅速将菌液和甘油溶液混匀。

分装冻存

1. 抽取菌液甘油混合液（每支冻存管分装0.5~1.0 mL）

2. 打开一支冻存管，将注射器伸入管底部，缓慢注入菌液

3. 迅速拧紧冻存管

4. 重复分装，所有操作迅速、轻柔，注射器禁止长期复用，降低交叉污染风险。

5、将密封好的冻存管，立即置于-80℃超低温冰箱，或液氮气相保存。不要长期存放于-20℃。

五、注意事项

胶塞穿刺：硅胶内塞支持多次穿刺，尽量选择不同位点。针头须锐利，穿刺前酒精消毒表面。

排气与压力平衡：接种时可以留置排气针（非必须操作），推注菌液和甘油时，动作应平缓，避免压力骤增影响操作。

注射器使用：每吸取一种新液体（菌液、甘油、还原剂）后，更换注射器，避免交叉污染。

还原剂用量：不可过量使用，以免抑制菌株生长。

厌氧验证：注意观察刃天青指示剂颜色。

冻存时效：甘油与菌液混合后，尽快冻存，以减少厌氧菌活力损失，以及漏氧风险。

六、常见问题

附录：还原剂配制

推荐使用成品还原剂溶液，若需自行制备，使用0.22 μm无菌滤膜除菌。

L-半胱氨酸盐酸盐溶液（推荐）

称取5.0-10 g L-半胱氨酸盐酸盐，溶于80 mL蒸馏水中，用2 mol/L NaOH调节pH至7.0左右，定容至100 mL，得到约5.0-10% (w/v)溶液，按10%-20%添加使用。

过滤除菌：在超净工作台内，使用0.22 μm滤膜过滤除菌，滤出液置入亨特管保存，备用。

九水硫化钠溶液

在通风橱中，称取2.4 g Na₂S·9H₂O，溶于80 mL蒸馏水，用HCl或NaOH调pH至8.0左右，定容至100 mL。

经0.22 μm滤膜过滤除菌，硫化钠对人体有毒，且还原性极强不易控制，操作须戴防护器具，不推荐新手用户自行配制。

参考文献

《Microbiology （Seventh Edition）》

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更新日期：2026-06-11

编制人：小藻

审稿人：小藻