细菌16S rRNA测序能否鉴定到属种（species），为什么保藏中心将16S测序作为鉴定依据？

引言

基于扩增子的细菌（包含古细菌）16S rRNA基因测序技术，是目前最经济高效的初步鉴定工具，尤其适合大规模菌株初筛，通常也是保藏中心鉴定细菌身份的“首选”手段

保藏中心确认细菌身份，为什么如此信赖16S测序？

16S rRNA测序技术是否能精确区分细菌的属种，甚至具体株型？

本次我们将围绕这些问题，结合专栏《细菌和古菌16S rRNA基因测序：原理、步骤、用途与示意图》（访问链接：https://www.huizaobio.com/article/a390.html），对16S rRNA测序技术进行更深入的挖掘和解析。

16S rRNA测序

为什么保藏中心依赖16S测序技术确认细菌身份？

首先，需明确的是，菌种保藏是一项偏基础科研建设的工作，通常由政府出资或牵头融资筹建，从立项起便将是一份旷日持久的系统工程。

关于保藏中心的介绍，另一专栏《微生物资源保藏中心的成立背景、目标使命、质量标准和其它相关事项说明（基于世界微生物联合委员WFCC指南）》（访问链接：https://www.huizaobio.com/article/a365.html），我们已经做了详尽介绍，不在此过多赘述。

基于保藏中心的定位，我们应当知道，菌种保藏工作耗时耗力，对稳定性要求较高，因此每一项技术的投入使用，均须斟酌。

16S rRNA基因测序，作为保藏中心最常用的，新分离培养物的初筛手段，正是考虑其在鉴定上，表现出的高效性、经济性和稳定性，同时结合不断成熟的模式株参照数据库，也符合保藏中心标准化流程的体系构建。

将16S序列与数据库中有效发表的模式株（validly published type strains），进行BLAST或系统发育树分析，根据相似度，将其作为新种候选或暂定种名。

事实上，鉴定工作通常已由原始分离人完成，保藏中心进一步审核确认。当然，随着新数据出现（如全基因组发布），原有基于基于16S的分类，是可能被修正的，这部分工作通常由保藏中心完成。

菌种纯培养物的DNA来源单一，PCR扩增目标明确特异性强，不易产生非特性性条带，测序准确性非常高，因此一代16S（Sanger测序）仍是保藏中心和微生物实验室的鉴定“金标准”。

综上，保藏中心选择16S鉴定细菌，是因为16S测序的价格便宜、使用便利，并且有庞大的模式细菌文库作为参照，保证准确性。

16S rRNA基因测序，能否鉴定到具体的细菌种属？

对于这个问题，首先要区分来源是，混合样本（如粪便，土壤，污水等），还是单菌纯培养物（挑单或稀释纯化），不同样本需解决的问题略有差别。

16S测序针对的是，原核生物30S小亚基中的一小段16S核糖体RNA（rRNA），基因全长约1500个碱基对（bp）。

16S序列结构，兼具保守区和可变区，其中可变区决定了种分类，整个16S rRNA包含9个高变区V1-V9。

对于混合样本，二代测序只检测部分可变区，很难鉴定到属。随着高通量测序技术的普及，针对整个V1-V9全长区域测序，分辨率更高，更容易鉴定到种水平。

目前，16S全长测序使用更频繁，不过混合样本的16S信号混杂，需通过聚类算法降噪区分物种，且对于低丰度污染难识别。

对于纯培养物，16S测序的DNA单一，通用引物可扩增出相对纯净的16S序列，无需聚类可合并出高质量的单一识别序列。

整个序列直接比对数据库（EZBioCloud/NCBI等），获取最相近的模式株，确认种级分类。

也就是说，16S不能在所有情况下，稳定鉴定到种；但在纯培养、数据库完善、种间差异明确的前提下，完全可以鉴定到种。

同时，应当认识到，16S只是分类工作的起点，宜配合其它手段，复核鉴定结果。

16S rRNA测序

对于许多关系密切的物种，16S序列高度相似，如何区分？

许多亲缘关系密切的物种（如 Bacillus cereus、B. anthracis 和 B. thuringiensis，16S序列高度相似（>99%），难以准确区分。

可结合不同基因水平的检测手段，对其深入鉴定：

宏观表征水平：表型特征分析，如形态、生化、生理特性等；

基因片段水平：除16S之外的看家基因，如rpoB（RNA polymerase β-subunit gene）, gyrB（DNA gyrase subunit B gene）, recA（Recombinase A gene）, dnaK（Heat shock protein 70 (Hsp70) gene），多基因系统发育分析（MLSA, Multi-Locus Sequence Analysis）等；

基因组水平：基因组ANI（Average Nucleotide Identity，平均核苷酸一致性）检测、dDDH（digital DNA-DNA Hybridization，数字化DNA-DNA杂交）技术等

从保藏中心取得一株标准株，如何确定其身份？

如何保证样本与期望一致，经常是研究人员最关注的问题。

不论是保藏中心来源，还是其它机构来源，最有效的方式，便是出具有效力的菌株COA证书，包含其鉴定和溯源信息。

鉴定信息，确保菌株种属明确，溯源信息则体现了转移和传代过程，我们通常认为，5代以内的变异风险在较低水平。

细菌相比真菌，基因组紧凑，重排倾向低，无性二分裂繁殖，DNA复制度高，变异累计速度相对缓慢，只要鉴定和溯源清晰，通常和原始分离株差异不大。

关于标准菌株的定义，参照专栏《标准菌株的定义，菌株小于5代内使用的黄金法则由来？》（访问链接：https://www.huizaobio.com/article/a363.html）。

另一方面，除16S测序鉴定外，可配合其它手段进一步确认菌株身份，参上。

16S rRNA全长基因测序，能否估算样本中的菌群丰度？

在对混合样本（如粪便、土壤）进行16S扩增子测序（无论是部分区域还是全长）：

每个细菌类群（如ASV或OTU）对应的测序读数（reads）数量，经过标准化（如总和为100%）后，可得到该类群在样本中的相对丰度。

相对丰度” ≠ “真实细胞比例：即使使用三代16S全长测序（如PacBio HiFi或Nanopore），偏差依然存在‘。

不同细菌基因组中16S rRNA基因拷贝数（Copy Number Variation）不同，如Bacillus：10–15 拷贝；Bifidobacterium：3–6 拷贝；Bacteroides：4–6 拷贝；Lactobacillus：1–8 拷贝（种间差异大）。

可能会出现，一个含10个拷贝的菌，即使细胞数更少，其16S信号也可能更强。

另外，DNA提取、PCR扩增效率、测序流程和数据库等差异，也会影响最终的丰度。

若研究需要接近真实的菌群丰度，建议通过宏基因组测序（Shotgun）、qPCR + 16S测序、流式细胞等技术，校正误差。

参考资料

细菌和古菌16S rRNA基因测序：原理、步骤、用途与示意图，https://www.huizaobio.com/JSZC-ZSJT/p1.html

微生物资源保藏中心的成立背景、目标使命、质量标准和其它相关事项说明, https://www.huizaobio.com/article/a365.html

16S rRNA Gene Sequencing for identification, classification and quantitation of microbes – LC Sciences – Technologies for Genomics & Proteomics Discoveries

Muhamad Rizal, N. S., et al. (2020). Advantages and Limitations of 16S rRNA Next-Generation Sequencing for Pathogen Identification in the Diagnostic Microbiology Laboratory: Perspectives from a Middle-Income Country. Diagnostics (Basel, Switzerland), 10(10), 816. https://doi.org/10.3390/diagnostics10100816

【相关资源】

名称：霍乱弧菌 | Vibrio cholerae

菌株编号：HZB368253, ATCC BAA-2163

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更新日期：2025-11-09

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