标准菌株的定义，菌株小于5代内使用的黄金法则由来？

引言

“标准菌株”这个概念在国内使用甚广，但是很多科研人员和使用者，其实对标准菌株的概念并无清晰认识。

本文将对标准菌株的定义、延伸概念、以及各概念的适用场景，进行一系列的说明，同时解释“菌株要在5代内使用”说法的由来。

标准菌株定义

根据现行国家标准《实验室质量控制规范-食品微生物检测》（GB/T 27405-2008）第3节中的术语和定义，标准菌株（reference strain）是至少定义到属或种水平的菌株，按其特征进行分类和描述，有明确的来源。

延伸理解后可进一步认为，标准菌株是来自受认可的国内外权威保藏机构，提供的原始菌株（或其它执行标准较高的派生菌株）。

比如，美国ATCC，德国DSMZ，日本JCM/NBRC，荷兰CBS，瑞典CCUG等海外权威保藏中心，以及国内的中国医学细菌保藏管理中心CMCC等。

ATCC冻干安瓿工艺

# 事实上，即使是这些专业保藏机构，有能力（资金、人力、时间等成本），且有意愿对本机构保藏菌株进行检查和鉴定，若要对纯度、活性、以及基因等进行全面检测并坚持执行，仍是一项富有挑战的工作。

标准菌株相关延伸概念

标准储备菌株（reference stocks）：标准菌株经过一代转接后获得的同种菌株。

应定期对其进行纯度和特性确认，推荐使用真空冻干法（冷冻干燥）、液氮或超低温冷冻保存，冷冻菌种避免反复冻融，并验证不同方法的保存时间。

工作菌株（working cultures）：由标准储备菌株转接后获得的同种菌株。

标准培养物（ reference cultures）：标准菌株、标准储备菌株和工作菌株的统称。

实验室质量控制规范

根据《2023版GMP指南（5）: 菌种管理》的描述，

“使用与标准菌株所有特性等效的，可以追溯的商业派生菌株”、

“工作菌株不可重新制备为标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株”。

# 注：更严谨地说应当是，非严格标准条件下，不可将其重新制备为标准菌株，若执行类似ATCC的标准，本身便是制备标准菌株的流程，便无可挑剔。

这里的重点是，使用派生菌株要有明确溯源，同时要进行纯度和特性鉴定工作。

另外，规定了，工作菌株和标准菌株的商业衍生物，不能作为标准菌株用于制备标准储备菌株。

但未规定工作菌株不得用于传代，那么也就是说商业衍生物及其传代菌株，在有明确溯源和验证工作的基础上，可以作为工作菌株使用。

# 注意事项：

常用的标准菌株保存时，建议应有两套。一套供保存传代用，另一套供日常使用时。

传代次数应严格控制，不得超过5代，防止过度传代增加菌种变异风险，标准菌株的商业衍生物仅可用于工作菌株。

为便于理解，在学术和工业实践中，标准菌株应具备以下特征：

身份准确，生物学分类，如种属信息无误，可通过16S rRNA测序等方法确定；

溯源清晰，通常具备国际权威保藏中心（如ATCC、DSMZ、CCTCC等）的保藏编号；

特征典型，表型和基因型特征明确等；

遗传稳定，多次传代后，典型特征可保持稳定。

黄金法则：工作菌株5代内使用

根据《中国药典：2020年版·四部-9203药品微生物实验室质量管理指导原则》，工作菌株的传代次数应严格控制在5代以内。起始代数为从菌种保藏机构获得的标准菌株，计为第0代。

在具体操作中，一次传代被定义为，将活的培养物接种到新的微生物生长培养基中进行培养。

无论形式如何，任何转种操作均被视为一次传代。为了确保实验结果的准确性和可靠性，实验室在有必要时需对工作菌株的特性和纯度加以确认。

这一规定的设置旨在，防范多次传代所可能导致的菌种遗传变异风险，但是“药典”中的表述，让研究人员很容易混淆“传代”与“代”的概念，日常使用中经常就会听到“这是几代菌”这样的表述。

细菌分裂一次其实也就是十几分钟，5代也就1小时的事情。“这是几代菌”实际上指的是，研究人员接收保藏中心的原始菌株后，传代操作做了几次。

菌株保存及传代流程图，S为储存菌株，W为工作菌株

# 常见问题

Q1 菌种传代次数必须在5代以内？超过5代是否可行？

5代以内使用的规定的，原本旨在防范多次传代可能导致的遗传变异风险。

因为繁殖快，微生物的遗传特性才得以明显表达，微生物才更能适应外界环境压力的变化。但是只要生长，或者说产生分裂，都可能产生变异。将菌种的传代次数控制在5代以内，是一项经过长期实践验证的经验结论。

这一指导原则的确立，旨在避免多次传代可能导致菌种遗传特性丧失或者发生变异，而变异可能影响其在研究和生产中的稳定性和生物活性。

通过限制传代次数至5代以内，可以有效减少遗传变异的风险，从而确保菌种在实验和生产中保持稳定的遗传特性及生物活性。这不仅提升了实验的可靠性，也保障了生产环节的产品质量。

遵循传代控制要求，不仅是对实验结果的一种保障，也是对菌种长久稳定利用的责任。因此，这一经验值在许多专业领域被广泛认可和应用。

# 超过5代是否可行？

“5代”这一限制既是基于长期微生物学实践经验的总结，也具有一定的理论依据。

在许多生物技术应用中，遵循这项传代限制已经成为确保实验和生产一致性的重要保障。通过严控传代次数，科学家可以更大程度地确保结果的可重复性和产品的高质量。

根据微生物学常识，菌种的传代次数与其遗传变异率之间存在正相关关系：传代次数越多，变异的风险也就越高。

虽然技术上并非完全禁止使用超过5代的菌种，但在超过5代后，菌种的稳定性和可靠性可能会受到挑战，增加意外问题出现的可能性。

若经过5代传代后，经过鉴定检查，菌种的形态结构、生理生化特性等依然保持不变，可以考虑继续使用。

但即便如此，多个传代在实验过程中仍然被不建议，因为这会显著增加变异和风险的可能性。

严格控制菌种传代在5代以内是，基于丰富的实践经验总结而来的最佳实践方法，以确保实验和生产流程在准确性和可靠性上保持不变。

坚持这一经验法则不仅是在保证实验结果的一致性，更是在规避不必要的研究风险。

Q2 如何确认是哪一代菌种？

在实际实验室环境中，有些实验室对菌种管理极为严格，而另一些实验室可能显得较为混乱。

由于实验的人员频繁更替和菌种的频繁使用，有时会出现难以追踪菌种代数的问题。面对这种普遍现象，我们只能以收到的菌种作为基础，将其视为第0代。

当接收到新的菌种时，我们首先需要进行，简单的形态学鉴定，以及生理生化特性检测，以评估菌株活力。

同时，扩增子测序鉴定也随着技术发展，愈来愈流行，可迅速实现菌株污染和纯度鉴定，缺点是种内污染难以区分。

如果这些指标没有问题，那么该菌种可以被视为F0，即母代菌种。但需要明确的是，这样的做法并不符合《中国药典》中规定的标准第0代菌种。

这种方法仅作为临时参考，并不适用于严格要求的实验环境。为了确保实验的稳定性和可靠性，还是应尽力遵循规定的实验菌种管理流程，标准化菌种的保存和使用，以避免在传代过程中出现更多不确定性。

Q3 商业公司提供的标准菌株衍生物，与权威保藏中心的差别是什么？

顾名思义，衍生物最初就是由标准菌株传代加工而来，即标准菌株的子代产品。

结合《2023版GMP指南（5）: 菌种管理》的描述，对于标准菌株，要求定期进行纯度和特性验证，工作菌株则是必要时进行纯度和特性验证。

因此，我们认为标准菌株衍生物可用于传代，作为工作菌株使用，但是不能作为标准储备菌株；每次传代都应该对纯度、特性等与实验相关的关键指标的确认，并且最好不要传代超过5代。

对于一些即用型产品，如定量菌株，理论上不应继续传代。

收到原始菌株时，每次传代多制备一批，即可满足日常工作需要，不建议使用工作菌株连续传代。

总结，标准菌株衍生物就是标准菌株的子代产品，或者子代工作菌株，其质量受保藏单位的工艺标准影响。

理论上，对于严格执行保藏质控流程的公司，其衍生物和标准菌株差距并不明显（一些容易产生突变的菌株除外）。

Q4 日常科研和生产使用的菌株，应当满足哪些标准？

最理想的情况是，所有实验样本，均使用来自权威保藏中心的标准菌株；

实际情况是，即使原代菌株是标准菌株，为了满足工作需要（数量），也需将其传代扩增，制备为标准储备菌株和工作菌株，最终用于科研和生产的为工作菌株。

遵循黄金法则，尽量使用5代以内的工作菌株最佳。

因此，我们的选择范围有以下几种：

（1）权威保藏中心提供的标准菌株，自行按照标准流程，将其传代扩增获得的工作菌株；

（2）普通保藏中心提供的菌株，受限于自身资源，有些保藏中心并不能，完全执行高标准的保藏收纳流程，其生物样本的复苏活性、表型特征、基因信息等，相比于ATCC、DSMZ、JCM、CCUG等国际知名保藏中心，仍具有明显差距，而且其可参考的文献信息也相对较少。但胜在资源多样性丰富，可作为我们的备选项；

（3）标准菌株衍生物，即传代后的工作菌株（按标准的保藏流程，一般为2-3代）。

这个范围包括：私立运营的菌株库、大型企业的功能菌株库（比如某些药厂自建的病原菌库）、实验室的小型菌库（高校、研究所、医院等），这些单位有时候，也作为保藏中心生物资源的原始来源。

Q5 如何建成和维护一家微生物保藏中心，并得到业内认可？

首先，要明确各大保藏中心均不以营利为目的，多是政府支持成立的公益性组织，其营收一般用来自身运营和科研支撑。

尽管组织架构方式不完全一样，但若要得到业内普遍认可，维护生物样本质量，肯定有一些必要程序须遵守和执行，我们将在另一篇专栏中，整理世界微生物菌种保藏中心联合会（WFCC），关于生物样本保藏的管理指南，供研究人员参考。

文章跳转：《微生物资源保藏中心的成立背景、目标使命、质量标准和其它相关事项说明（基于世界微生物联合委员WFCC指南）》，访问链接： https://www.huizaobio.com/article/a365.html

参考资料

《实验室质量控制规范-食品微生物检测》（GB/T 27405-2008）

《2023版GMP指南（5）: 菌种管理》

《中国药典：2020年版·四部-9203药品微生物实验室质量管理指导原则》

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更新日期：2025-08-28

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