为什么你养的丝状真菌总是不产孢？丝状真菌产孢机制介绍

引言

近年来，丝状真菌在新材料、生物制造、生物农业和生态保护等方面，表现出越来越多的潜在价值。其中，丝状真菌的产孢是实现高效接种的关键，对于菌种培养、选育和保存提供了便利。尤其是，在农业领域，微生物在病虫害防治，微生物肥料等方面，需要足够数量的孢子，能提高丝状真菌的利用效率。

“为什么你养的丝状真菌不产孢？”这个问题总是困惑着相关领域的科研人员，丝状真菌的产孢机制是其应用的核心环节。本文将结合数篇文献，讲述丝状真菌产孢的相关机制。

产孢机制研究

一、《Influence of temperature, humidity, and light on the growth and sporulation of Aschersonia aleyrodis》

评估了温度、相对湿度和光照，对昆虫病原真菌 Aschersonia aleyrodis 菌丝生长和产孢的影响。

1. 温度 (Temperature)

最佳温度：

25℃ 是菌丝生长和产孢的最适温度。=

在此温度下，10天后菌落直径达到最大值 8.0 cm。

15天后的孢子产量也达到峰值，为 2.04 × 10⁶ 孢子/mL。

适宜温度范围：

研究表明，20℃ 至 30℃ 的温度范围是 A. aleyrodis 生长和产孢的优化区间。在此范围内，真菌能保持较高的代谢活性和繁殖能力。

不适宜温度：

在 15℃ 和 35℃ 时，生长和产孢显著下降（菌落直径分别为 2.6 cm 和 3.2 cm，孢子产量分别为 1.17 × 10⁶ 和 1.29 × 10⁶ 孢子/mL）。

在 40℃ 时，生长受到严重抑制（菌落直径仅 1.4 cm），并且完全不产生孢子。

# 应优先将培养温度设定在25℃左右，避免超过35℃；如果生长缓慢，可尝试20-30℃的范围进行梯度优化。

2. 相对湿度 (Relative Humidity, RH)

最佳湿度：

100% RH 和 85% RH 条件下，菌丝生长和产孢效果最佳。

在100% RH下，菌落直径达到 9.0 cm，孢子产量为 2.14 × 10⁶ 孢子/mL。

在85% RH下，菌落直径为 8.9 cm，孢子产量为 2.09 × 10⁶ 孢子/mL。

高湿度范围：

在 90% RH 和 95% RH 条件下，同样获得了显著且高水平的生长（8.6 cm）和产孢（约 2.0 × 10⁶ 孢子/mL）。

最低要求：

即使在 80% RH 的条件下，该真菌也能获得相当可观的生长（8.4 cm）和产孢（1.92 × 10⁶ 孢子/mL），但效果略低于更高湿度的条件。

# 可以通过在培养容器中放置水盘、使用密封袋或在培养基中加入适量的琼脂，来减少水分蒸发，从而维持高湿度。文献明确指出，高湿度是真菌完成生长和孢子生产所必需的“强制性要求”。

3. 光照 (Light)

最佳光照：

连续光照（由40W白色荧光灯提供）条件最有利于生长和产孢。

在此条件下，菌落生长最快，10天后平均直径为 9.0 cm。

15天后产孢量也最高，为 1.61 × 10⁶ 孢子/mL。

次佳光照：

12小时光照/12小时黑暗的交替周期 也支持较好的生长和产孢，菌落直径为 7.3 cm，孢子产量为 1.46 × 10⁶ 孢子/mL。

最差条件：

完全黑暗条件下，生长和产孢均受到明显抑制。

菌落直径最小，仅为 5.2 cm。

孢子产量也最低，为 1.19 × 10⁶ 孢子/mL。

形态学差异：

光照不仅影响数量，还影响菌落形态。在连续光照下，菌落呈奶油白色并带有同心圆环；而在完全黑暗下，菌落呈白色且无同心环。这表明光照在调控菌丝生长模式和发育过程中扮演着重要角色。

# 如果您的目标是最大化产孢，应考虑将培养物置于持续光照下。如果条件有限，12小时光暗循环也是一个可行的选择。应避免将培养物长期置于完全黑暗的环境中，因为这会显著降低产孢效率。

二、《PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY OF FUNGAL SPORULATION》

核心观点：产孢是一个受多种环境信号、生物钟、大分子合成和细胞极性共同调控的复杂生理过程。

1. 环境因素：光照 (Light)

光质 (Light Quality/Wavelength)：

蓝光 (Blue Light)： 多项研究明确指出，蓝光是诱导多种真菌（如 Trichoderma, Physarum）产孢的关键波段。

白光/可见光 (White/Visible Light)：研究表明可见光，对产孢有显著效应。

紫外线 (UV Light)： 真菌菌丝中存在能吸收紫外线的物质，可能与光诱导的产孢过程有关。

光作用机制：

光形态发生 (Photomorphogenesis)： “光诱导的形态发生”表明光不仅影响产孢的“量”，还影响其“质”和发育路径。

光感受器 (Photoreceptors)： “蓝光感受器”说明其分子机制在当时已被探索。

2. 环境因素：其他物理与化学条件

# 气体环境

如果条件允许，可以尝试在培养皿中创造一个密闭或半密闭环境，让菌丝自身的呼吸作用积累一定CO₂，观察是否影响产孢。

# 物理刺激

在菌丝生长后期，可以尝试用无菌针轻轻划伤菌落表面，模拟“损伤”信号，看是否能诱导局部产孢。

# 化学信号

可以尝试在培养基中添加一些已知的植物激素或次级代谢物前体，看是否有诱导效果。

3. 生理与生物节律：生物钟 (Circadian Rhythm)

昼夜节律 (Circadian Rhythm)：真菌的产孢受到内源性生物钟的调控，产孢不是随机的，而是在一天中的特定时间（如光暗转换时）更易发生。

# 这解释了为什么许多产孢实验采用光暗循环（如12小时光/12小时暗），比连续光照效果更好。

# 光暗转换是一个强大的“时间信号”，可以同步菌丝的生物钟，使整个群体在特定时间点集中启动产孢。

4. 生物化学与分子基础：大分子合成

产孢可能经历特殊的DNA复制或修复过程。

产孢需要特异基因的转录激活，是基因表达重编程的结果。

产孢需要合成大量特定的结构蛋白和酶。

蓝光感受器对“葡萄糖代谢”的调控，说明能量代谢与产孢密切相关。

5. 特殊发育模式

真菌可以根据环境条件选择不同的发育策略。

“同步化产孢”，说明通过特定的培养方法（如更换培养基），可以使整个群体的产孢过程同步进行，这对于研究产孢机制非常有利。

如果目标是快速获得孢子，可以探索是否存在诱导“微循环产孢”的条件（如特定的胁迫或营养条件）。而“同步化”方法则有助于您在固定时间点收获大量状态一致的孢子。

光照方案： 采用光暗循环（如12小时光照/12小时黑暗），利用其对生物钟的同步作用。光源优先选择白光或蓝光。

环境节律： 认识到产孢受内源性生物钟调控。保持培养环境的光照周期稳定，避免频繁打扰。

两段式培养： 先在丰富培养基上生长，再转移到贫瘠培养基上诱导。

轻度胁迫： 如轻微的渗透压变化（添加少量NaCl或甘油）、短暂的营养饥饿或无菌物理损伤，以模拟自然环境中的产孢诱导信号。

代谢支持： 确保培养基提供均衡的营养，特别是碳源，以支持产孢过程中的大量生物合成。

探索同步化： 尝试通过“更换培养液”或“转移菌丝块”等方法，诱导群体产孢的同步化，以便于集中收获。

产孢机制研究

三、《Investigating diverse methods for inducing sporulation in endophytic fungi》

核心观点：内生真菌的产孢，需要模拟其宿主环境，或施加特定胁迫

内生真菌在宿主体内通常不产孢，其产孢程序被抑制。在体外培养时，它们常常保持“沉默”。

因此，产孢诱导的本质是通过各种物理、化学或生物方法，模拟其在自然生态系统中可能遇到的环境信号或胁迫，从而“唤醒”其产孢能力。

1. 环境因素：光照 (Light)

方法： 使用近紫外光 (near-ultraviolet radiation) 进行照射。

近紫外光能诱导多种真菌产孢，这可能是因为紫外线作为一种胁迫信号，触发了真菌的繁殖机制以应对不利环境。

2. 环境因素：气体与化学诱导

方法： 使用乙炔 (acetylene) 气体。

效果与依据： 文献中提到这是“一种众所周知的诱导产孢的化学方法”。乙炔可能模拟了植物根际或损伤组织释放的气体信号，从而诱导与植物共生的内生真菌产孢。

# 这是一种独特的化学气体诱导法。可以在密闭容器中通入少量乙炔气体，观察其对产孢的影响。

3. 培养基成分：碳源与特殊添加剂

方法1：纤维素 (Cellulose)：

在含有纤维素的培养基上，Bipolaris, Curvularia, Drechslera, 和 Exserohilum 属的真菌产孢量显著增强。

可能是因为这些真菌，在自然环境中能分解植物细胞壁，纤维素作为其天然底物，提供了产孢的信号。

# 如果内生真菌来源于植物组织，可以在培养基中添加滤纸条、脱脂棉或微晶纤维素，模拟其天然的木质纤维素环境。

方法2：生物素 (Biotin)：

生物素能诱导桑树炭疽菌 (Colletotrichum dematium) 产孢。生物素是多种羧化酶的辅因子，参与脂肪酸和氨基酸代谢，其浓度变化可能影响细胞的代谢状态，从而触发发育转换。

方法3：盐胁迫 (Salinity)：

适度的盐胁迫（如NaCl）可以作为一种渗透压胁迫，诱导真菌启动繁殖程序。

# 尝试在培养基中添加低浓度的NaCl（如0.5-2%），观察是否能诱导产孢。注意浓度不宜过高，以免完全抑制生长。

方法4：海水或盐水培养 (Seawater or Saline Medium)：

效果与依据： 对于来源于海洋环境（如海藻内生菌）的真菌，使用人工海水或含盐培养基是模拟其自然生境的有效方法。

4. 培养方法与物理处理

方法1：滤纸桥培养法 (Filter paper bridge method)：

描述： 在主培养皿与一个装有特定诱导剂（如乙炔、挥发性化合物）的小瓶之间架设一条滤纸桥。诱导剂的挥发性分子通过滤纸扩散到主培养皿中，作用于真菌。

效果： 避免了诱导剂直接接触对菌丝的毒性，同时实现了气体或挥发性化学物质的温和递送。

对您的启示： 这是一种巧妙的间接诱导法，特别适合测试有毒或高浓度的化学诱导剂。

方法2：打孔法 (Punching method)：

描述： 用无菌打孔器在生长良好的菌落上打出小孔。

效果与依据： 这是一种物理损伤方法，损伤可以模拟宿主组织的伤口，释放出诱导信号。

对您的启示： 操作简单，可以在菌落成熟时进行，是一种有效的物理刺激手段。

方法3：气生菌丝诱导法 (Aerial mycelium induction)：

描述： 通过降低培养基湿度、使用疏水性培养皿或提高培养温度等方法，促进气生菌丝的形成。

效果与依据： 大多数丝状真菌的产孢结构（分生孢子梗）都是从气生菌丝上产生的。因此，促进气生菌丝的形成是产孢的前提。

对您的启示： 确保培养环境有利于气生菌丝生长。可以尝试将培养皿的盖子稍微打开一条缝，或者使用透气性封口膜，以降低表面湿度。

方法4：交替温度法 (Alternating temperature regime)：

描述： 将培养物在两种不同温度（如25°C/15°C）之间循环。

效果与依据： 模拟昼夜温差，这种周期性的环境变化可以作为一种强烈的发育信号。

对您的启示： 如果您的培养箱支持，可以设置自动的温度循环程序，模拟自然环境的昼夜节律。

5. 模拟宿主环境

方法：使用宿主植物组织提取物 (Host plant tissue extracts)：

描述： 将宿主植物的叶片、茎或根的提取物加入到培养基中。

效果与依据： 这是最直接的模拟方法。宿主组织中的化学物质（如酚类、黄酮、植物激素）可能含有维持内生状态或诱导产孢的信号分子。

对您的启示： 如果您知道菌株的来源植物，强烈建议尝试此方法。制备新鲜的植物组织匀浆或水提物，过滤灭菌后加入培养基。

推荐的综合优化策略：

培养基： 首先尝试贫瘠培养基（如PDA或MEA），这是产孢的基础。

光照： 采用12小时光照/12小时黑暗的循环，利用光暗转换的信号。

初级诱导（温和刺激）：

气生菌丝： 确保培养条件有利于气生菌丝生长（适度干燥）。

宿主模拟： 如果可能，添加宿主植物提取物。

营养模拟： 添加滤纸条或脱脂棉（纤维素源）。

中级诱导（化学/物理刺激）：

化学诱导： 在培养基中添加低浓度NaCl（渗透胁迫）或微量生物素。

物理诱导： 在菌落成熟时进行打孔或轻微划伤。

高级诱导（强效信号）：

气体诱导： 使用滤纸桥法引入乙炔气体。

胁迫诱导： 尝试近紫外光照射（短时间，注意安全）。

# 关键提示： 内生真菌产孢可能需要数周甚至数月，需长期观察； 单一方法可能无效，建议组合使用多种方法（如：宿主提取物 + 滤纸条 + 光暗循环 + 打孔）； 详细记录每种方法的处理时间和效果，以便找到最佳组合。

四、《丝状真菌产孢机制及其相关基因研究进展》

核心观点：产孢是一个受遗传程序、环境信号和营养状态共同调控的多阶段发育过程

产孢不是随机事件，而是真菌在特定发育阶段，响应内外信号后启动的一系列有序的细胞分化程序。

1. 影响产孢的因素

A. 发育能力 (Developmental Competence)

真菌必须经过一段时间的营养生长后，才能获得“应答外界发育诱导信号的能力”。在 Aspergillus nidulans（构巢曲霉）中，这个“成熟期”至少需要20小时。

这是一个内在的、遗传程序驱动的现象。连续更换新鲜培养基也无法缩短这个时间。存在“早熟突变体”（precocious mutants），其获得产孢能力的时间更短，这证明了该过程受基因控制。

# 不要过早诱导产孢。在接种后，应给予菌丝足够的时间（通常3-7天，具体视菌株而定）进行充分的营养生长，使其达到“发育成熟”状态。在此之前施加诱导信号，效果会很差。

B. 外界诱导信号 (External Inductive Signals)

空气/气液界面 (Air/Liquid Interface)： 文献提到，在液体深层培养时，菌丝必须暴露在空气中才开始产孢。这通常被认为是形成了“水/空气界面”，而非简单的氧气浓度变化。这个界面为气生菌丝和产孢结构的形成提供了物理基础。

光 (Light)： 光是一个关键的诱导信号。文献提到 A. nidulans 存在“光可逆诱导现象”，暗示其含有类似植物色素的光感受器，可以调节发育。这与您之前阅读的文献完全一致。

对您的启示：

固体培养： 这是最直接模拟“空气暴露”的方法。确保培养基表面干燥，有利于气生菌丝形成。

液体培养： 如果必须在液体中诱导，可以考虑使用浅层培养、摇床培养（增加气液接触）或在培养后期将菌丝转移到固体培养基上。

C. 营养缺失与环境压力 (Nutrient Depletion & Environmental Stress)

产孢是真菌应对不良环境的生存策略。

从完全培养基转移到，缺乏某种组分的培养基可诱导产孢。

环境压力： 高温、高压、干燥等逆境也能诱导产孢。

对您的启示： 这是最核心的优化策略之一。采用“两段式培养法”：

第一阶段（营养生长）： 在营养丰富的培养基（如PDB液体或PDA平板）上快速扩增菌体量。

第二阶段（产孢诱导）： 将菌丝体（或孢子）转移到贫瘠的培养基（如仅含碳源的琼脂、水琼脂或无机盐培养基）上，以模拟营养耗尽的环境，从而解除对产孢的抑制。

2. 产孢的分子机制及相关基因

文献以模式生物 Aspergillus nidulans 和 Neurospora crassa 为例，详细阐述了调控网络。

A. 关键调控途径 (Core Regulatory Pathways)

brlA-abaA-wetA 通路：

brlA： 产孢的“总开关”。其表达是启动产孢的必要条件。缺失则不产孢，过表达则强制产孢。

abaA： 在 brlA 激活后发挥作用，负责产孢结构的正常分化。

wetA： 负责分生孢子的成熟和休眠，影响孢子的耐受性和寿命。

对您的启示： 任何能促进 brlA 表达的条件（如营养耗尽、光照）都是有效的。确保产孢过程完成到最后阶段，以获得高质量的孢子。

flb 基因家族通路：

包括 flbA, flbB, flbC, flbD, flbE, flbG 等基因。

作用： 这些基因与上述 brlA-abaA-wetA 通路协同工作，共同调节产孢。它们可能位于 brlA 的上游，参与感知和传递环境信号。

对您的启示： 这表明产孢调控网络非常复杂，涉及多个信号输入点。这解释了为什么多种不同的诱导方法（光、营养、损伤）都能最终汇聚到激活 brlA 上。

B. 其他丝状真菌中的产孢相关基因

文献列举了多种植物病原真菌中的例子，证明了产孢调控的普遍性：

PTK1（网斑病菌）： 细胞分裂素活化蛋白激酶基因，影响产孢和毒力。

FCC1（轮枝样镰刀菌）： 拟细胞周期蛋白基因，参与产孢的信号转导。

BMK1（稻平脐蠕孢菌）： MAP激酶基因，是产孢和毒力的关键基因。

MTP1（稻瘟病菌）： 编码跨膜蛋白，与产孢和孢子萌发相关。

对您的启示： MAPK信号通路和蛋白激酶在多种真菌的产孢中扮演重要角色。这提示我们，环境信号（如胁迫）可能通过激酶级联反应最终调控核心转录因子。

3. 特殊产孢方式：微循环产孢 (Microcycle Conidiation)

指孢子萌发后，不进行或仅有极微弱的营养菌丝生长，直接进行产孢的现象。这相当于“跳过了”大部分的营养生长阶段。

诱导因素：

高温： 超过最适生长温度可诱导（如黑曲霉）。

营养缺陷： 可诱导。

其他因素： 变温处理、高密度接种、特定化学物质（如黄曲霉中的多胺）。

优势：

提前产孢时间、提高产孢总量、保持毒力

可以尝试通过以下方法诱导微循环产孢：

在孢子萌发初期施加轻度热激（如短暂提高2-5°C）。

使用贫瘠的萌发培养基。

进行高密度接种。

添加文献中提到的特定诱导物（如多胺，但需先确认对您的菌株有效）。

第一阶段：充分营养生长

在丰富培养基上培养3-7天，确保菌丝发育成熟，获得“产孢能力”。

第二阶段：诱导产孢

培养基： 转移到贫瘠培养基上，模拟营养耗尽。

物理环境：

使用固体培养，确保良好的气生菌丝生长。

采用12小时光照/12小时黑暗的循环。

特殊策略（可选）：

尝试诱导微循环产孢： 在萌发阶段施加轻度热激或使用贫瘠萌发培养基。

添加宿主组织提取物或纤维素（如滤纸条）以模拟自然生境。

监测与收获：

耐心观察，产孢可能需要1-3周。

确保产孢过程完成，以获得成熟、有活力的孢子。

敬请关注“灰藻视界”，共筑健康未来！
— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

灰藻生物：我们期待着与客户共同成长，共创生命科学的美好未来！

更新日期：2025-09-23

编制人：小藻