细菌和古菌16S rRNA基因测序：原理、步骤、用途与示意图

引言

16S rRNA基因测序是一种基于扩增子的高通量测序方法，广泛用于鉴定和分类生物样本中的细菌群落。其核心在于：原核生物含有16S核糖体RNA（rRNA）基因，其序列既包含高度保守的区域，也包含具有物种特异性的可变区。前者便于设计通用引物进行扩增，后者则可用于区分不同种类。最早于1977年提出，并奠定了现代微生物系统分类的基础。

相比之下，传统培养法耗时费力，只能检测到样本中少数的微生物。而16S rRNA测序结合新一代测序技术，实现了对复杂微生物群落的快速、高效解析。正因如此，许多过去无法通过培养获得的微生物，如今已通过16S rRNA测序被成功识别并纳入数据库。

什么是16S rRNA基因？

16S rRNA基因序列是，目前研究细菌分类与系统发育，最常用的遗传标记。

核糖体是负责蛋白质合成的分子器件，由蛋白质和核糖体RNA（rRNA）组成，包含大小两个亚基。

在原核生物中，核糖体由30S小亚基和50S大亚基构成，共同组装成完整的70S核糖体（“S”为斯维德贝格单位，表示沉降系数）。其中，30S亚基包含一条16S rRNA分子和21种蛋白质。

16S rRNA基因全长约1500个碱基对（bp），其序列结构兼具保守区与可变区：

保守区在不同细菌间高度相似，适合设计通用引物，实现对各类细菌16S基因的广泛扩增；

可变区则在不同物种间存在明显差异，可用于区分和鉴定具体的微生物种类。

整个16S rRNA基因包含9个高变区（V1–V9），这些区域的序列多样性为细菌的系统发育分析、群落组成解析以及在复杂环境中的物种识别提供了关键依据。

正因这种“保守中有变异”的特性，16S rRNA基因成为微生物生态学、临床诊断和环境监测等领域不可或缺的分子工具。

16S rRNA基因测序的原理

16S rRNA基因测序基于扩增子测序（amplicon sequencing）技术，其核心原理是：

通过靶向扩增并测序原核生物（包括细菌和古菌）基因组中，高度保守的16S rRNA基因特定区域，利用该基因序列的保守性，与变异性来实现微生物的鉴定与分类。

所有细菌和古菌均含有16S rRNA基因，其整体结构高度保守，确保了通用引物能够有效扩增来自不同物种的该基因片段；

基因内部散布的可变区（如V3–V4等）在不同物种间存在序列差异，为区分近缘微生物提供了分子依据。因此，16S rRNA基因被广泛用作，原核生物系统发育和群落分析的“分子条形码”。

完整的测序流程包括：

16S rRNA基因测序的主要步骤

1. 样本采集

首先，从目标环境中采集微生物样本，来源包括土壤、水体、空气，或人体/动物的生物样本（如粪便、口腔拭子、皮肤等）。

不同类型的样本需采用相应的采集和保存方法，并严格避免外源污染。

在DNA提取前，常需进行预处理（如酶解、加热或物理清洗）以去除宿主细胞、腐殖酸或其他干扰物质，提高后续DNA提取的纯度与代表性。

2. DNA提取

样本采集后，需从中提取总基因组DNA。

物理破碎：如超声处理、珠磨法，用于裂解细胞壁； 化学裂解：使用去污剂（如SDS）和蛋白酶K等破坏细胞膜并降解蛋白质； 纯化：通过柱纯化、磁珠或酚-氯仿抽提等方法去除杂质，获得高纯度DNA。 提取的DNA质量直接影响后续PCR扩增效率和测序结果的可靠性。

3. PCR扩增与文库构建

旨在为测序准备标准化的DNA文库：

首先，使用针对16S rRNA基因保守区的通用引物（如341F/806R靶向V3–V4区）进行PCR扩增；引物选择和反应条件优化对避免非特异性扩增至关重要。

扩增产物随后被加上测序平台所需的接头（adapters）和样本特异性条形码（barcodes），以便多份样本混合测序后能准确区分。

文库还需经过纯化（如磁珠分选）以去除多余的引物和接头，并控制片段大小均一性，确保测序质量。

4. 测序

构建好的文库通过高通量测序平台进行测序。常用平台包括：

Illumina（如MiSeq、NovaSeq）：主流选择，读长适中、通量高、错误率低； Ion Torrent、Oxford Nanopore、PacBio：适用于长读长需求，但错误率相对较高； Sanger测序：仅适用于单一菌株的16S全长测序，不适用于复杂群落。 测序过程可同时产生数万至数百万条序列读段（reads），原始数据随后进入生物信息学分析流程。

5. 数据分析

测序完成后，需借助生物信息学工具，对数据进行系统处理与解读，主要步骤包括：

质控与过滤：去除低质量读段、接头序列及非目标域（如真核生物或叶绿体）序列； 序列拼接与去噪：将双端读段合并，并生成精确的扩增子序列变体（ASV）或聚类为操作分类单元（OTU）； 物种注释：将ASV/OTU与参考数据库（如 SILVA、Greengenes、EzBioCloud）比对，赋予分类学身份（界、门、纲、目、科、属，有时到种）； 多样性分析：计算α多样性（样本内丰富度与均匀度）和β多样性（样本间群落差异），并进行统计与可视化。

常用分析流程包括 QIIME 2、MOTHUR 和 USEARCH/UPARSE，这些工具提供标准化流程、详细教程和用户友好界面，广泛应用于科研与临床研究。

16S rRNA测序

16S rRNA基因测序的优势

16S rRNA基因在细菌和古菌中高度保守，同时又包含足够的序列变异，足以区分不同物种。

与传统的培养方法相比，16S rRNA基因测序，无需依赖微生物的体外培养，可直接从环境或临床样本（如土壤、水体、肠道内容物等）中解析整个微生物群落，尤其能够检测大量不可培养（unculturable）的微生物——这类微生物占自然界微生物总数的90%以上，传统方法难以触及。

借助高通量测序技术（如Illumina平台），一次实验即可同时对成千上万个16S rRNA基因片段进行测序，实现对多个样本的大规模、高效率分析，显著提升了研究通量与覆盖深度。

此外，传统培养方法依赖菌落形态、生化反应等表型特征，不仅主观性强、耗时长，还容易受污染干扰。而16S rRNA基因测序采用标准化实验流程，并结合经过验证的生物信息学分析流程（如QIIME 2、MOTHUR等），内置严格的质量控制步骤，能有效减少人为误差，提高结果的可重复性与准确性。

综上，16S rRNA基因测序以其无需培养、高通量、高灵敏度和标准化程度高等优势，已成为现代微生物生态学、临床诊断和环境监测等领域的核心技术手段。

16S rRNA基因测序的局限性

分类分辨率有限：16S rRNA基因通常只能可靠地将细菌鉴定到属（genus）水平，对种（species）甚至株（strain）水平的区分能力较弱。许多亲缘关系密切的物种（如 Bacillus cereus、B. anthracis 和 B. thuringiensis；或 Escherichia coli 与部分 Shigella 菌种）在16S序列上高度相似（>99%），难以准确区分。

高序列相似性 ≠ 同一物种：即使两个菌株的16S rRNA基因序列几乎完全相同，它们在生理特性、致病性或代谢功能上仍可能存在显著差异。因此，仅凭16S数据进行物种鉴定有时会得出误导性结论。

依赖生物信息学分析：测序产生的数据量庞大且复杂，需借助专业软件（如 QIIME 2、MOTHUR、DADA2 等）进行质控、去噪、聚类和注释。这要求研究人员具备一定的生物信息学基础，否则易因参数设置不当或数据库选择偏差影响结果可靠性。

分辨率低于宏基因组测序：相比于鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomics），16S测序仅靶向单一标记基因，无法提供全基因组信息，在物种分辨能力和系统发育精度上明显逊色。

无法揭示功能信息：16S rRNA测序仅反映“谁在那里”（Who is there?），但不能回答“它们能做什么”（What are they doing?）。由于不涉及功能基因，该方法无法直接推断微生物群落的代谢潜能、抗生素抗性、毒力因子等关键功能特征。

综上，16S rRNA基因测序是一种高效、经济的群落结构筛查工具，但在需要高精度物种鉴定或功能解析的研究中，常需结合全基因组测序、宏基因组学或宏转录组学等更深入的技术手段。

16S rRNA基因测序的应用

16S rRNA基因测序广泛应用于多个领域，主要用于解析复杂样本中微生物的物种组成与群落结构，从而揭示微生物多样性及其在生态系统中的功能与相互作用。以下是其主要应用场景：

1. 微生物生态学研究

通过分析土壤、水体、沉积物、空气等环境样本中的细菌和古菌群落，研究人员可评估微生物多样性、群落演替规律及环境因子对微生物分布的影响，为生态修复和生物地球化学循环研究提供依据。

2. 临床与医学微生物学

在临床领域，16S测序被用于： 探究疾病（如炎症性肠病、肥胖、糖尿病、牙周炎、败血症等）与人体微生物组失衡的关联； 鉴定传统培养方法难以检出的病原菌； 辅助诊断不明原因感染，尤其适用于无菌部位（如脑脊液、关节液）中低丰度病原体的检测； 研究医院环境中耐药菌的传播与定植动态。

3. 食品安全与发酵工业

监控发酵食品（如酸奶、泡菜、酱油、奶酪）中的有益菌群，优化生产工艺； 快速识别食源性致病菌（如 Salmonella、Listeria、Clostridium 等），保障食品卫生安全； 追踪食品加工链中的微生物污染来源。

4. 农业与植物健康

分析根际、叶际及土壤微生物组，挖掘促进植物生长、抗病或固氮的功能菌群； 指导微生物肥料或生物农药的开发； 评估耕作方式、化肥使用或转基因作物对土壤微生态的影响。

5. 人类微生物组研究

作为“人类微生物组计划”（Human Microbiome Project, HMP）的核心技术之一，16S测序系统描绘了人体各部位（肠道、口腔、皮肤、阴道等）的正常菌群图谱，推动了对微生物与免疫、代谢、神经发育等健康过程关系的理解。

6. 新物种发现与系统分类

通过比对未知菌株的16S序列与数据库，可初步判断其是否为潜在新种。当序列相似度低于98.7%（通常作为种界定阈值）时，可能提示新分类单元的存在，为进一步分类学研究提供线索。

典型应用

人类微生物组计划（HMP）：全面刻画人体共生微生物组成；

全球海洋采样远征（Global Ocean Sampling Expedition）：揭示海洋微生物的全球分布与多样性；

土壤微生物组研究：评估土地利用变化或气候变化对土壤生态的影响；

医院耐药菌监测：追踪多重耐药菌在病房或ICU中的传播路径；

污水处理系统监控：优化工艺参数，提升有机物降解与脱氮除磷效率。

总之，16S rRNA基因测序凭借其高通量、低成本和无需培养的优势，已成为连接基础研究与实际应用的重要桥梁，在环境、健康、农业和工业等多个领域持续发挥关键作用。

参考资料

16S and ITS rRNA Sequencing | Identify bacteria & fungi with NGS (illumina.com)

16S rRNA Gene Sequencing for identification, classification and quantitation of microbes – LC Sciences – Technologies for Genomics & Proteomics Discoveries

Muhamad Rizal, N. S., et al. (2020). Advantages and Limitations of 16S rRNA Next-Generation Sequencing for Pathogen Identification in the Diagnostic Microbiology Laboratory: Perspectives from a Middle-Income Country. Diagnostics (Basel, Switzerland), 10(10), 816. https://doi.org/10.3390/diagnostics10100816

【相关资源】

名称：霍乱弧菌 | Vibrio cholerae

菌株编号：HZB368253, ATCC BAA-2163

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更新日期：2025-11-09

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