产甲烷菌、甲基营养菌与甲烷氧化菌：分类、代谢与生态功能的系统化对比分析

一、 引言

1. 背景与意义

甲烷作为强效温室气体与潜在能源，其生物地球化学循环至关重要。微生物是驱动该循环的核心引擎。

简要介绍产甲烷菌、甲基营养菌和甲烷氧化菌在全球碳循环，特别是甲烷生成与消耗过程中的核心地位。

系统梳理三者在分类学、代谢、生态、培养与应用等方面的核心差异与联系，为相关研究与技术开发提供清晰框架。

2. 核心概念

o 产甲烷菌 (Methanogens)：严格厌氧古菌，利用简单C1化合物或乙酸产生甲烷作为能量代谢的终产物。

o 甲烷氧化菌 (Methanotrophs)：好氧/厌氧细菌/古菌，以甲烷作为唯一碳源和能源进行氧化。

o 甲基营养菌 (Methylotrophs)：更广义的细菌和真菌，能够利用不含C-C键的C1化合物（如甲烷、甲醇、甲胺等）作为碳源生长，但不一定以甲烷为底物。

3. 相互关系

三者构成甲烷循环的关键环节——产甲烷菌是甲烷的“生产者”，甲烷氧化菌是主要的“消费者”，而甲基营养菌是更广泛的“C1化合物利用者”，彼此在代谢路径和生态位上既有衔接又有显著分野。

二、 分类学地位与系统发育

1. 产甲烷菌

o 域/界：古菌域 (Archaea)。

o 主要类群：广古菌门 (Euryarchaeota) 下的多个纲，如甲烷杆菌纲 (Methanobacteria)、甲烷球菌纲 (Methanococci)、甲烷微菌纲 (Methanomicrobia) 等。

o 关键特征：细胞壁不含肽聚糖（假肽聚糖或其他成分），膜脂为醚键连接的分支链烃。

2. 甲烷氧化菌

o 域/界：细菌域 (Bacteria)，部分属于古菌域（厌氧甲烷氧化古菌，ANME）。

o 好氧甲烷氧化菌主要类群：

 α-变形菌纲：如甲基球菌属 (Methylococcus)、甲基杆菌属 (Methylobacterium，部分)。

 γ-变形菌纲：如甲基单胞菌属 (Methylomonas)、甲基球菌属 (Methylococcus)、甲基囊菌属 (Methylocystis)。

o 厌氧甲烷氧化古菌 (ANME)：通常与硫酸盐还原菌等共生，属于甲烷微菌纲等。

o 关键特征：含有甲烷单加氧酶 (MMO) 关键酶。3. 甲基营养菌

o 域/界：细菌域为主，部分为真菌（如某些酵母）。

o 主要类群：分布广泛，多见于α-、β-、γ-变形菌纲（如 Methylobacterium, Methylobacillus, Methylophilus），以及厚壁菌门等。

o 关键特征：分类学上非单系群，是一类功能性的集合，根据利用的C1底物（甲醇、甲胺、甲基硫化物等）进一步细分。

对比小结：产甲烷菌是独特的古菌；甲烷氧化菌主要是细菌，部分为古菌（ANME）；甲基营养菌是跨越多类群的功能性细菌（及部分真菌）集合。三者系统发育起源迥异。

三、 代谢途径与能量获取

1. 产甲烷菌：甲烷生成（还原性代谢）

o 底物：H₂/CO₂、甲酸、乙酸、甲醇、甲胺等。

o 核心路径：以独特的辅酶（如CoM, CoB, F420）为媒介，通过产甲烷作用将底物还原为CH₄。

o 能量学：通过化学渗透作用建立质子/钠离子梯度合成ATP，是一种严格的厌氧呼吸过程。

2. 甲烷氧化菌：甲烷氧化（氧化性代谢）

o 好氧型：

 第一步：甲烷单加氧酶 (MMO) 将CH₄氧化为甲醇。

 后续路径：甲醇→甲醛→甲酸→CO₂（同化与异化）。

 同化途径：核酮糖单磷酸途径 (RuMP, γ-变形菌) 或丝氨酸途径 (α-变形菌)。

 能量：通过甲醇至CO₂的氧化过程与电子传递链耦合产生ATP。

o 厌氧型 (ANME)：

 通常与互营伙伴（如硫酸盐还原菌）耦合，通过“逆向产甲烷作用”将CH₄氧化，同时还原硫酸盐等电子受体。

3. 甲基营养菌：C1化合物同化与异化

o 底物多样性：甲醇、甲胺、甲基硫化物、卤代甲烷等（但不一定包括甲烷）。

o 核心特征：缺乏MMO，但拥有丰富的C1化合物脱氢/转化酶（如甲醇脱氢酶MDH）。

o 同化途径：与好氧甲烷氧化菌类似，主要采用RuMP途径、丝氨酸途径或己糖磷酸途径。

o 能量：通过氧化C1化合物（非甲烷）获取能量。

对比小结：代谢方向上，产甲烷菌是还原性产甲烷，后两者是氧化性利用C1化合物。底物特异性上，甲烷氧化菌专一于甲烷，甲基营养菌利用多种C1化合物（非甲烷或包括甲烷），产甲烷菌利用简单C1物及乙酸。能量代谢模式分别对应严格的厌氧呼吸、好氧/厌氧呼吸和好氧呼吸。

四、 生态功能与生境

1. 产甲烷菌

o 功能：作为终端分解者，在无氧环境中将有机物最终转化为甲烷，是湿地、稻田、反刍动物瘤胃、垃圾填埋场、厌氧消化器等环境甲烷的主要来源。

o 生境：严格的厌氧环境（Eh < -200 mV），如深层沉积物、沼泽、胃肠道、厌氧反应器。2. 甲烷氧化菌

o 功能：是大气和生态系统甲烷通量的关键生物过滤器，在甲烷排放到大气之前将其氧化消耗，估计消耗全球约50-90%的生物源甲烷。

o 生境：

 好氧型：厌氧-好氧界面（如土壤表层、湿地根际、湖泊水柱氧化层、垃圾填埋场覆盖土）。

 厌氧型 (ANME)：海洋沉积物、冷泉、热液等硫酸盐-甲烷交替带。3. 甲基营养菌

o 功能：参与多种C1化合物的全球循环（如甲醇、甲胺、卤代甲烷等），是连接甲烷循环与其他元素循环（氮、硫、卤素）的重要桥梁。

o 生境：分布极广，从土壤、水体、植物叶面（利用植物释放的甲醇）到极端环境。

对比小结：在碳循环中，三者构成“产生（产甲烷菌）— 专性消耗（甲烷氧化菌）— 广义转化（甲基营养菌）”的功能链。生境从严格厌氧（产甲烷菌），到微好氧界面（好氧甲烷氧化菌），再到广泛的好氧环境（甲基营养菌），形成了空间与代谢上的接力与互补。

五、 实验室培养与研究方法

1. 产甲烷菌

o 培养条件：极端严格厌氧（Hungate滚管技术、厌氧工作站），使用还原性培养基，常添加碳酸氢盐作为碳源/缓冲剂，H₂/CO₂或特定底物作为能源。

o 鉴定：16S rRNA基因测序，产甲烷活性检测（气相色谱测CH₄），辅酶F420自发荧光观察。2. 甲烷氧化菌

o 培养条件：

 好氧型：以甲烷-空气混合气（通常10-30% CH₄）作为底物，在液体或固体培养基上培养，对铜离子浓度敏感（调控MMO类型）。

 厌氧型 (ANME)：极难纯培养，多采用富集培养物或共培养体系，模拟原位条件（如连续生物反应器）。

o 鉴定：16S rRNA/pmoA（颗粒性MMO亚基基因）功能基因分析，稳定同位素探针技术 (SIP)，脂质生物标志物（如特定的甾醇）。3. 甲基营养菌

o 培养条件：相对容易，好氧培养，以甲醇、甲胺等特定C1化合物作为唯一碳源添加于基础盐培养基。

o 鉴定：16S rRNA基因测序，底物利用谱测试，关键酶（如MDH）活性测定。

对比小结：培养难度通常为：厌氧甲烷氧化菌 > 产甲烷菌 > 好氧甲烷氧化菌 > 甲基营养菌。对气体底物和氧气控制的要求是区分培养技术的关键。

六、 生物技术应用潜力

1. 产甲烷菌

o 核心应用：厌氧消化/沼气工程的核心功能菌群，将有机废弃物转化为可再生能源（甲烷）。

o 新兴方向：电化学产甲烷（微生物电合成），CO₂生物固定与转化。

2. 甲烷氧化菌

o 核心应用：

 甲烷减排：生物滤床处理煤矿瓦斯、垃圾填埋场废气。

 单细胞蛋白：利用甲烷生产饲料蛋白（历史悠久）。

 生物转化：生产甲醇、可降解塑料（PHA）、生物燃料前体等。

o 新兴方向：共代谢降解地下水有机污染物（如TCE）。

3. 甲基营养菌

o 核心应用：

 工业生物技术：作为细胞工厂，利用甲醇等廉价C1原料高效生产高值化学品（如氨基酸、维生素、重组蛋白）。因其代谢路径简单、无碳损失备受青睐。

 生物修复：降解卤代甲烷等有毒C1污染物。

o 新兴方向：合成生物学底盘细胞的开发（如 Methylotuvimicrobium buryatense 5GB1C 等）。

对比小结：应用导向差异明显——产甲烷菌主攻能源化；甲烷氧化菌聚焦于甲烷废气治理与增值转化；甲基营养菌（尤指甲基营养型细菌）则在工业生物制造领域展现出巨大潜力，旨在替代糖基原料。

七、 结论与展望

1. 系统总结：重申三者在分类学起源、代谢网络（还原 vs. 氧化；底物专一性 vs. 广谱性）、生态角色（生产、过滤、联通）上构成一个既分工明确又紧密联系的甲烷/C1化合物循环功能网络。

2. 当前挑战：厌氧甲烷氧化菌群的培养与机制解析仍存瓶颈；对复杂环境中三者互作的微观生态过程认识不足；将代谢潜力高效转化为稳定工业化工艺仍需突破。

3. 未来展望：

o 基础研究：借助宏基因组/转录组等组学技术，揭示未培养物种的功能及群落的互作机制。

o 技术融合：将合成生物学工具应用于改造甲烷氧化菌和甲基营养菌，提升其对甲烷和甲醇的固定效率与产物多样性。

o 系统整合：开发模拟自然生态功能的“人工微生物群落”，用于更高效、更稳定的废气处理与生物制造，实现从“认识循环”到“设计与驾驭循环”的跨越。

参考链接

https://www.dsmz.de/fileadmin/Bereiche/Microbiology/Dateien/Kultivierungshinweise/Kultivierungshinweise_neu_CD/engl_Methanogens_Update.pdf

https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/DSM-800

https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/DSM-18500

https://www.atcc.org/products/33009

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附录1：产甲烷菌的培养

产甲烷菌是一类多样化的严格厌氧微生物，在自然界中分布广泛，存在于各种永久性缺氧生境中，如淹水土壤、沉积物、污水污泥消化器或某些动物的消化道。所有已知的产甲烷菌都属于古菌域，对氧气极度敏感。产甲烷菌的标志性特征是将C1化合物（例如，CO₂、甲醇、甲酸或N-甲基基团）还原为甲烷（CH₄）。该代谢途径中的一些酶和辅因子是独特的，因此仅存在于产甲烷菌中。参与产甲烷作用的辅酶F420会使细胞在短波紫外光激发下产生强烈的自发荧光。这种自发荧光是一种诊断特征，可通过落射荧光显微镜检查产甲烷菌培养物是否受到污染。

下文以培养巴氏甲烷八叠球菌 (Methanosarcina barkeri) DSM 800T 为例，详细说明产甲烷菌的推荐操作方法。M. barkeri 是最早被分离获得纯培养的产甲烷菌物种之一。与其他产甲烷菌相比，其代谢非常多样，也能利用乙酸作为碳源和能源（Bryant and Boone, 1987）。菌株与培养检查

M. barkeri DSM 800T 使用DSMZ 120a培养基培养，并以5ml等分试样封装于亨盖特管中送达。收到后，请通过相差显微镜检查培养物样本。为此，需使用按照DSMZ技术资料《厌氧菌培养》所述方法进行无氧处理的1ml注射器，无菌操作吸取部分培养物。

在显微镜下，该菌株的细胞表现为非运动性、大型、形状不规则的球状体，通常成团出现。某些甲烷八叠球菌菌株偶尔会形成直径达1000 µm的大型聚集体，肉眼可见。图1A展示了巴氏甲烷八叠球菌的相差显微照片，而图1B的落射荧光显微照片则显示了这些细胞典型的蓝绿色自发荧光。

图1、DSM 800T 的相差显微照片（A）和落射荧光显微照片（B）。标尺：10 µm
培养基准备

为菌株DSM 800T制备推荐的DSMZ 120a培养基。

这种产甲烷菌能以甲醇为底物良好生长，因此无需提供H₂/CO₂混合气体。

注意：除了甲烷八叠球菌属以外的、仅能以H₂/CO₂为底物生长的产甲烷菌，是在用H₂/CO₂制备的培养基中提供的。这些菌株的小瓶会用80% H₂和20% CO₂的混合气体加压至0.5到1巴。为了培养这些菌株，必须定期补充新鲜的混合气体，以避免因消耗H₂/CO₂而产生负压，并去除产生的CH₄。接种与培养

接种前，还原含有氧化还原指示剂刃天青的120a培养基，方法是注射还原剂硫化物和半胱氨酸。等待培养基完全变为无色（氧化还原电位低于-110 mV）。然后，将0.25 ml处于对数生长后期的DSM 800T培养物转移到5 ml新鲜制备的120a培养基中。在30-37°C下培养最多一周。生长和产甲烷（气泡）在培养48小时内即可见。

注意：在甲醇上生长的甲烷八叠球菌物种可根据以下公式产生大量气体：

4 CH₃OH → 3 CH₄ + CO₂ + 2 H₂O

与其他在封闭小瓶中生长可能产生过高压力的微生物类似，甲烷八叠球菌属应在能够承受相当大压力的培养容器（例如Balch管）中培养，且液体培养基只填充至容器的25%。此外，应至少每天对快速生长的培养物进行排气，以避免压力过高。在处理产生过高压力的培养物时，请佩戴防护眼镜！生长特征与保藏

在液体培养物中，生长常呈絮凝状，始于形成大的细胞聚集体，这些聚集体会沉降到小瓶底部。培养期间无需摇动试管。巴氏甲烷八叠球菌菌株通常在实验室批式培养中生长良好，在生长阶段末期常能达到OD600nm 0.5以上的浊度。

培养至稳定期早期的DSM 800T及相关菌株的培养物，在4-10°C下可稳定保存长达四周。

附录2：甲烷氧化菌的培养培养基

• ATCC 1306号培养基：硝酸盐矿物盐培养基 (NMS)（注意：可适当调整微量盐元素溶液）培养条件

• 温度：37°C

• 气体环境：50% 甲烷，50% 空气操作流程

1. 复壮：开始操作前，将冷冻保存管置于室温解冻。

2. 接种：将保存管内的全部内容物无菌转移至一支装有5-6 mL NMS肉汤培养基的试管中。

o 可通过转移0.1 mL至斜面或0.5 mL至其他肉汤管的方式进行额外接种。

o 取0.1 mL复壮后的培养物，涂布于TSA培养基平板上（用于纯度检测）。

o 注意：使用NMS培养基时，需提供50%甲烷和50%空气的混合气体。

3. 培养：将培养物置于37°C摇床中培养3至7天。

o 使用NMS培养基时，为获得最佳效果，需每24至48小时补充一次50%甲烷和50%空气的混合气体。

4. 生长观察：生长应在3至7天内出现。在TSA等非选择性平板上应无生长。操作备注

摇动培养促进生长。不摇动也可生长，但摇动能使生长更快、培养物更浑浊。

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更新日期：2026-01-05

编制人：小灰

审稿人：小藻