乳酚棉蓝染色法：原理、操作及其在真菌形态学鉴定中的应用
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：6 发布时间：2025-12-23 21:24:51
引言
真菌的快速准确鉴定在微生物学、临床诊断及环境监测中具有重要意义。
乳酚棉蓝染色法（Lactophenol Cotton Blue ，LPCB）作为一种经典的真菌显微制片技术，凭借其操作简便、染色清晰的特点，已成为实验室初步鉴别真菌的重要工具。
该方法通过特异性染色真菌细胞壁中的几丁质成分，同时实现样本封固与结构保存，使菌丝、孢子等关键形态特征在显微镜下得以清晰呈现。
本文将系统阐述该技术的染色原理、标准化操作流程、结果判读要点及其应用局限性，为相关科研与检测工作提供参考。
乳酚棉蓝染色原理
该方法基于对真菌细胞壁的特异性染色以辅助鉴定。
真菌为具有宏观与微观特征的真核生物。其孢子细胞壁主要成分为几丁质，而乳酚棉蓝染液中的成分可针对该结构进行染色。该溶液兼具封固与染色双重功能，呈清澈蓝色，由以下三种主要试剂组成：
• 苯酚：作为消毒剂灭活微生物
• 乳酸：保存真菌形态结构
• 棉蓝：对真菌细胞壁几丁质及其他结构进行染色
染色后，真菌孢子及菌丝等结构呈现蓝色。
乳酚棉蓝染液配制
制备50ml乳酚棉蓝染液需以下组分：
• 蒸馏水 50ml
• 棉蓝（苯胺蓝） 0.125g
• 苯酚晶体（C₆H₅OH） 50g
• 甘油 100ml
• 乳酸（CH₃CHOHCOOH） 50ml
• 70%乙醇
注：染液需提前至少两天配制。
染液制备步骤
乳酚棉蓝染液需经两日静置以充分溶解与熟化：
• 第一日：将棉蓝溶于蒸馏水，静置过夜以去除不溶性染料颗粒
• 第二日：佩戴防护手套，将苯酚晶体加入乳酸中，磁力搅拌至完全溶解后加入甘油。过滤棉蓝溶液至苯酚-甘油-乳酸混合液中，混匀后室温储存
染色操作流程
1. 在洁净载玻片上滴加70%乙醇
2. 用接种环等无菌工具取真菌样本（固体培养基）置于乙醇液滴中
3. 用无菌针头将样本在乙醇中轻轻铺开，确保充分浸润
4. 在乙醇挥发前，用滴管加入1-2滴乳酚棉蓝染液
5. 轻柔盖上盖玻片，避免产生气泡
6. 显微镜下使用40倍物镜观察真菌孢子及附属结构
结果判读
真菌孢子、菌丝及产孢结构均染为蓝色，背景呈淡蓝色。示例如下：
• 黑曲霉菌丝及产孢结构呈清晰蓝色，背景淡蓝
• 须癣毛癣菌呈现类似染色特征
图1、乳酚棉蓝染色下的帚霉属真菌（图片来源：stylish_streaking与Senthil Prabhu）
技术局限性
• 仅作为真菌推定鉴定方法，需结合生化与培养鉴定
• 试剂与染液需在有效期内使用
• 可能影响真菌原始形态结构
• 仅适用于成熟真菌形态，不适用于幼嫩营养体
• 染液保存期有限
应用领域
• 疑似真菌样本的初步鉴定
• 真菌及其结构的常规形态学识别
总结
乳酚棉蓝染色法通过苯酚的固定作用、乳酸的形态保存及棉蓝对几丁质的特异性着色，实现了对真菌结构的有效显现。标准化操作流程涵盖染液配制、样本处理与显微观察三个关键环节，其结果以蓝色菌体与淡蓝背景形成鲜明对比。尽管该方法存在仅适用于成熟结构、可能影响原始形态及需配套验证等局限，但其作为一项经济、快捷的初筛技术，在真菌的形态学初步鉴定中仍具有不可替代的价值。在实际应用中，建议结合分子鉴定或培养特性分析，以达成更为精准的分类鉴定结论。
参考文献
https://microbenotes.com/lactophenol-cotton-blue-staining/
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更新日期：2025-12-20
编制人：小灰
审稿人：小藻