微孔板读数器（酶标仪）：细菌生长定量分析的高通量标准化技术平台
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：24 发布时间：2026-01-30 17:45:22
引言
在微生物学研究中，细菌生长的精确定量分析是基础研究、药物开发及食品微生物学等领域的核心。传统基于分光光度计（比色皿）的培养测量方法，存在通量低、操作繁琐、易引入人为误差，及难以动态连续监测等固有缺陷。
微孔板读数器（Microplate Reader），亦称酶标仪，是高度集成化的，高通量光学检测系统，通过自动化并行分析、精准环境控制及多模式检测能力，革新了细菌生长分析的研究范式，已成为微生物实验室，常见的标准化工具。
图1、微孔板读数器
1. 微孔板读数器：定义与核心测量原理
微孔板读数器是专为微孔板（如96孔、384孔板）设计的，高通量精密光学检测仪器。
其本质是一个自动化、多通道的比色计或分光光度计系统，核心功能是通过检测光与孔内样品的相互作用，将生物化学信号，转化为可量化的数据。
其标准化工作流程，遵循以下光学路径：
1.1. 光源激发：
氙灯或卤素灯发出复合光，经单色器（光栅型，波长连续可调）或滤光片（滤光片型，需物理更换），筛选出特定波长的单色光。
1.2. 光-样品相互作用：
单色光垂直穿过样品，发生3种作用：
o 吸收：溶液中的特定分子吸收光子（如核酸在260 nm）
o 散射：悬浮颗粒（如细菌细胞）使光子偏离原路径
o 发射：荧光或化学发光物质受激后释放更长波长的光子
1.3. 信号捕获与处理：
透射光或发射光由高灵敏度检测器（如光电二极管、光电倍增管PMT）接收。仪器通常采用双通道设计（样品信号与参比信号），以校正光源波动。
最终，电信号经放大和模数转换，由内置软件根据相应物理定律（如朗伯-比尔定律）或标准曲线计算出浓度、活性等定量结果。
2. 细菌生长分析的关键测量方法
2.1 OD600：基于光散射的浊度法定量
测量600 nm波长下的光信号变化，是监测细菌悬液浓度的常用方法，其本质是散射测量，而非纯粹的吸光度测量：
在该波长下，细菌细胞对光的吸收极弱，信号衰减主要源于细胞引起的米氏散射（Mie Scattering）。细胞浓度越高，散射越强，到达检测器的透射光越弱，仪器即记录为更高的光密度（OD）值。
• 间接定量：在悬液浓度适中时（通常OD值 ≤ 1.0），OD值与活菌总数或细胞密度呈线性正相关，从而实现非破坏性的间接定量。
• 光程校正：微孔板中样品的实际光程受加样体积影响，并非固定的1 cm。高端仪器通过Z轴聚焦调整或软件算法进行校正，确保不同体积间数据的可比性。
2.2 生长曲线动力学解析
通过设定固定时间间隔（如10-15分钟）的连续自动监测，仪器软件可绘制出高时间分辨率的生长动力学曲线，并精确定量各个生长阶段：
• 迟滞期：细菌适应新环境的准备阶段。
• 对数生长期：细胞以最大恒定速率进行指数分裂的阶段，可准确计算比生长速率和倍增时间。
• 稳定期：营养物质耗竭或代谢产物积累导致生长与死亡达到动态平衡。
• 衰亡期：活细胞数量开始下降的阶段。
2.3 多模式检测：拓展生理学分析维度
现代多功能微孔板读数器整合了多种检测模块，可提供超越单纯细胞密度的深层生理信息：
| 检测模式 | 原理简述 | 在细菌研究中的应用示例 |
|---|---|---|
| 荧光强度 | 特定激发光激发荧光团（如GFP），检测其发射光强度。 | 报告基因表达动态实时追踪、膜电位探针（如DiOC₂）评估细胞活力。 |
| 生物发光 | 检测酶促化学反应（如萤光素酶-底物反应）自发释放的光子，无需激发光。 | ATP检测试剂评估总代谢活性、基于荧光素酶的基因表达或细菌数量检测。 |
| 时间分辨荧光共振能量转移 | 利用镧系元素螯合物的长寿命荧光，延时检测能量转移，极大降低背景干扰。 | 研究细菌内蛋白质-蛋白质相互作用、信号通路分子间结合。 |
| 氧消耗检测 | 基于氧敏感荧光探针的荧光寿命或强度与氧浓度反相关的原理。 | 实时监测细菌呼吸速率、评估抗生素的代谢抑制效应。 |
# 酶标仪缺点，
3. 环境控制：保障实验可重复性的基石
专业的微孔板读数器集成了精确的环境控制模块，以消除物理因素波动对细菌生长的影响，这是实现高通量实验可靠性和可重复性的关键。
• 精准温控：控温范围通常覆盖室温+3℃至65℃，均匀性可达±0.5℃以内，确保病原菌（37℃）或环境菌（如30℃）在最适温度下稳定生长。
• 智能振荡：提供线性、轨道或双轨道等多种振荡模式，防止细胞沉降，并保证好氧培养中氧气的有效传递。
• 气体调控（高端机型）：集成CO₂和/或O₂浓度控制模块，可精确模拟体内微环境或厌氧条件，支持长期动力学研究和苛刻微生物的培养。
4. 核心应用领域
1. 抗生素敏感性筛选：是测定最小抑菌浓度（MIC） 的黄金标准。通过在96/384孔板中平行测试抗生素的系列稀释浓度，可高效、精确地判定抑制细菌生长的临界浓度。
2. 噬菌体-宿主互作研究：通过高时间分辨率监测OD值的突然下降，能够灵敏、客观地捕捉噬菌体裂解宿主菌的动态过程，为噬菌体疗法提供关键动力学参数。
3. 生物膜分析：结合结晶紫等染色方法，可对生物膜的形成能力进行高通量定量，有效区分浮游菌与生物膜菌的表型差异。
4. 微生物污染监测：在制药工业中，应用基于微孔板的动力学显色法或浊度法进行鲎试剂内毒素（LAL）检测，实现高灵敏度的快速质控。
5. 相较于传统分光光度计方法的优势
| 优势维度 | 传统分光光度计（比色皿）局限 | 微孔板读数器技术突破 |
|---|---|---|
| 通量与效率 | 单样本逐次测量，耗时费力。 | 96或384孔同步平行检测，实验效率提升数十至上百倍。 |
| 自动化与连续性 | 需频繁人工取样开盖操作，扰动培养体系，数据点离散。 | 全程无人值守，在密封板内进行连续、无扰动的动态监测，获得完整、连续的生长曲线。 |
| 样品消耗与成本 | 通常需要2-3 mL样品体积。 | 仅需50-200 μL/孔，极大节约珍贵试剂、菌株和化合物库的成本。 |
| 数据质量与操作 | 手动操作和记录易引入误差；无法自动计算动力学参数。 | 软件自动记录、处理数据，并可精确计算比生长速率、倍增时间等关键参数，标准化程度高。 |
| 功能扩展性 | 通常仅具备吸光度检测功能。 | 一体化平台：集成吸光、荧光、发光、FRET等多模式检测及培养环境控制，实现“培养-检测-分析”全流程整合。 |
6. 实验操作要点
为确保获得最优实验结果，需注意：
• 板型选择：使用透明平底板进行OD检测；进行荧光检测时，推荐使用黑色孔壁板以降低交叉信号和背景干扰。
• 体积一致性：加样体积直接影响光程，需保持孔间一致，并利用仪器校正功能。
• 设置合理对照：必须包含仅含培养基的空白对照，以扣除培养基自身的背景吸收或荧光。
• 仪器校准与维护：定期进行光路校准和性能验证，确保数据长期稳定可靠。
结语
微孔板读数器，凭借其卓越的高通量能力、自动化操作、精准的环境控制以及多维度的检测功能，已将细菌生长分析从一项繁琐、易错的手工操作，转变为高效、精准、信息丰富的标准化流程。
提升了基础微生物学研究的效率和深度，在抗生素研发、感染生物学、微生物组学，及工业微生物检测等应用领域，发挥着不可替代的作用。
参考文献
https://microbenotes.com/optimisation-bacterial-growth-analysis-microplate-readers/
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更新日期：2026-01-27
编制人：小灰
审稿人：小藻