质粒入门指南1:质粒是什么?(上) (What is a Plasmid?) (1/2)

一、质粒简史

生物芽孢（Bioblasts）？质粒基因（Plasmagenes）？在 20 世纪 40 年代和 50 年代，科学家们致力于了解细胞间可转移的细胞质遗传因子。当时，这些核外遗传因子被认为既是寄生虫、共生体，又是基因。由于对这些因子在生物体内所起作用的认知十分有限，加之相关研究尚处于起步阶段，因此针对它们的命名显得模糊且充满矛盾。

1. 质粒（Plasmid）一词的由来

1952 年，约书亚·莱德伯格（Joshua Lederberg）着手厘清这些细胞质遗传因子的分类。他提出了一个包罗万象的术语“质粒（Plasmid）”，该词由“细胞质（Cytoplasm）”和拉丁语后缀“id”（意为“它”）组合而成，被定义为“任何核外遗传决定簇的通用术语”。然而，他的这一提议在当时基本被忽视。

几年后，埃利·雅各布（Élie Jacob）和弗朗索瓦·沃尔曼（François Wollman）提出了另一个术语“附加体（Episome）”，将其定义为“一种非必需的遗传元件，既可独立存在，也可整合到染色体中”。这一术语随后被广泛采用。

在当时看来，使用“附加体”似乎很合适，尤其是因为埃丝特·莱德伯格（Ester Lederberg）在 1952 年发现的致育因子（F 因子）在某些情况下会被整合到大肠杆菌的染色体中。这一命名一直沿用到 20 世纪 60 年代，当时科学家们开始研究其他核外颗粒，特别是抗药性因子（R 因子）。与 F 因子类似，R 因子也可以通过细胞间的直接接触在细菌之间转移；然而，科学家们注意到，与 F 因子不同，现有证据并不支持 R 因子能够整合到染色体中的假说。因此，“附加体”一词最终被弃用，而“质粒”这一名称则一直沿用至今！

2. 从餐巾纸到实验记录本

尽管质粒在 20 世纪 50 年代初就被发现，但直到 70 年代才在科学界崭露头角。在此之前，噬菌体（尤其是 λ 噬菌体）是分子生物学家研究细菌遗传学的首选工具。这一局面的改变，部分归功于 1972 年在夏威夷一家熟食店发起的一次合作。

几位科学家（包括斯坦利·法尔科、斯坦利·科恩、赫伯特·博耶和查尔斯·布林顿）以熟食店的餐巾纸为纸，提出了一个大胆的想法：利用新发现的 EcoRI 限制性内切酶（及其可预测的切割位点）来进行首个质粒“克隆”实验。科恩博士及其同事用 EcoRI 处理了耐四环素质粒 pSC101 和新开发的耐卡那霉素质粒 pSC102，并筛选出对这两种抗生素均具有抗性的大肠杆菌转化子。当这一实验被证明成功后，pSC101 成为了第一个质粒克隆载体，分子生物学也由此迎来了历史性的转折。

图 1：pSC101图谱

在接下来的几年里，来自不同细菌（最终也包括哺乳动物）物种的基因被克隆到质粒中，并且开发出了如 pBR322、pACYC 和 pUC 等新型克隆载体。这些载体具有更高的拷贝数，极大地推动了克隆实验的发展。

尽管质粒最初只是一个相对小众的研究领域，但如今它们已成为一种无处不在的工具，广泛应用于各种实验中。Addgene 的成立正是为了存储、进行质量控制（QC）、整理和分发这些质粒，旨在让科学家的研究工作变得更加便捷！自 20 世纪 50 年代被发现以来，质粒对分子生物学的众多领域产生了深远影响，并在推动我们对细菌接合与重组、复制与拓扑结构，以及克隆与基因表达等知识的理解方面发挥了关键作用。

二、什么是质粒？

从最基本的层面来看，质粒是能够独立于宿主染色体 DNA 进行复制的小型环状 DNA 分子。它们主要存在于细菌中，但也天然存在于古菌和真核生物（如酵母和植物）中。在自然界中，质粒能为宿主提供一种或多种功能性益处，例如抗生素抗性、降解功能以及致病性。所有天然质粒都包含一个复制起点（用于控制质粒的宿主范围和拷贝数），并且通常包含一个有利于生存的基因，例如抗生素抗性基因。

相比之下，实验室中使用的质粒通常是人工构建的，旨在将外源 DNA 导入另一个细胞中。实验室构建的质粒至少包含一个复制起点、一个筛选标记和一个克隆位点。质粒易于修饰且能在细胞内自我复制的特性，使其成为生命科学家和生物工程师极具吸引力的研究工具。

1. 如何在实验室中构建质粒？

由于其人工构建的属性，实验室质粒通常被称为“载体”或“构建体”。为了将目的基因插入载体，科学家可以利用多种克隆方法（如限制性内切酶克隆、非连接依赖克隆、Gateway 克隆、Gibson 组装等）。克隆方法的选择最终取决于目标质粒载体的类型。无论如何，一旦克隆步骤完成，含有新插入基因的载体就会被转化到细菌细胞中，并在含有抗生素的培养皿上进行选择性培养。

图 2：质粒图谱

重要的是，由于用于提取质粒的细菌生长迅速，且在生长过程中会不断扩增质粒，因此科学家可以轻松制备大量质粒，以便在后续工作中进行操纵和使用。

2. 科学家如何使用质粒？

通常，科学家利用质粒来操纵靶细胞中的基因表达。由于具备灵活性、多功能性、安全性和成本效益等特性，分子生物学家得以在广泛的应用领域中普遍使用质粒。常见的质粒类型包括：克隆质粒、表达质粒、基因敲低质粒、报告基因质粒、病毒质粒以及基因组工程质粒。

质粒的众多用途包括但不限于：

• 大量生产蛋白质，以便科学家在受控环境中对其进行纯化和研究。
• 生产发光蛋白，以便科学家追踪其在细胞内的位置或数量。
• 监测特定环境中的化学物质水平。
• 生产特定的酶，以对生物体的基因组进行精确、可控的改变（即基因组工程）。
• 生产可用于科学研究或疾病治疗的合成病毒。

表 1.1 质粒载体元件

三、复制起点

让我们来看看质粒的另一个基本元件：复制起点或“复制子”。复制子由复制起点（ORI）及其所有调控元件组成。复制起点是 DNA 复制起始的位置，它使质粒能够在细胞内存活所必需的自我复制成为可能。

质粒的复制子通常与用于复制宿主染色体 DNA 的复制子不同，但它们仍然依赖宿主细胞的机制来合成额外的拷贝。复制起点的序列通常富含腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）；A-T 碱基对之间通过两个氢键连接，而 G-C 碱基对之间则是三个氢键。因此，富含 A-T 碱基对的 DNA 片段在较低温度下更容易发生解链（Melting）。DNA 解链后，会为复制机制提供进入的空间，从而启动拷贝的合成。

1. 众多的复制起点

自然界中存在大量的复制起点。目前，我们暂且忽略真核细胞和病毒中使用的复制起点，仅关注细菌中发现的复制起点。您可能会遇到的一些常见复制起点包括 ColE1、pMB1（具有几种略有不同但广为人知的衍生体）、pSC101、R6K 和 15A。并非所有的复制起点都是等同的。根据其调控方式的不同，有些复制起点会产生大量的质粒拷贝，而有些则只产生少量的拷贝。通常，根据复制起点是分别受 RNA 还是蛋白质正向调控，复制调控被分为“松弛型（Relaxed）”或“严谨型（Stringent）”。质粒的拷贝数取决于正向调控与负向调控之间的平衡，并且可以通过复制子中的突变来进行人为操纵。例如，pMB1 复制起点在每个细胞中维持约 20 个拷贝，而仅有两处突变差异的 pUC 复制起点，每个细胞可产生多达 700 个拷贝。

那么，该如何进行选择呢？您可以问自己以下几个问题：

o 该质粒是仅用于大肠杆菌？还是用于一般的革兰氏阴性菌？亦或是同时用于革兰氏阴性和革兰氏阳性菌？

o 您的细胞中是否在同一时间只存在一种质粒？

o 您是否需要大量制备该质粒？该基因在高拷贝量时是否具有毒性？

请务必牢记：即使是中低拷贝数的质粒，只要配备合适的启动子和生长条件，依然能够表达出大量的蛋白质。

表 1.2 常见载体复制起点信息

*实际拷贝数会有所变化。

**复制需要 pir 基因。

***F1 是一种源自噬菌体的复制起点，允许单链 DNA（ssDNA）的复制并被包装进噬菌体颗粒中。含有噬菌体衍生复制起点的质粒被称为噬菌粒。

2. 明智地选择复制起点

复制起点的最佳选择取决于您希望维持的质粒拷贝数、计划使用的宿主种类，以及是否需要考虑到您的质粒与其他一种或多种质粒的相容性。通常来说，具有相同复制起点的质粒是不相容的，因为它们会竞争相同的复制机制，从而造成不稳定且不可预测的环境。原则上，同一不相容群的质粒不应被共转化（Co-transformed）。因此，如果您的实验需要两种质粒，请确保它们具有“相容”的复制起点。详情请参阅下表。

上述表格突出了常见的克隆载体、它们的拷贝数、复制起点以及不相容群。请注意，A-C 的不相容群分类是人为指定的，同一不相容群的质粒不应被共转化。

3. 影响拷贝数的其他因素

尽管复制起点的序列和调控机制会显著影响质粒的拷贝数，但其他外部因素同样会产生影响。如果您计划纯化质粒 DNA，请特别留意以下考量因素。

插入片段：如果质粒含有较大的插入片段或会产生毒性产物的基因，细菌往往会维持较少的质粒拷贝数。

大肠杆菌菌株：大多数大肠杆菌菌株都可用于质粒的扩增，但 endA-（核酸内切酶 A 缺陷型）大肠杆菌是获得高产量质粒的最佳选择。

4. 生长条件

通气量、温度、培养体积、抗生素种类及培养基成分均会影响质粒的拷贝数。某些复制起点具有温度敏感性；另一些复制起点则可以通过添加氯霉素来“诱导”其扩增出更多的拷贝——请确保您的生长条件不会对质粒扩增产生反作用！

5. 培养物接种

新划线培养的细菌具有更高的质粒拷贝数。为获得最佳结果，请始终挑取单克隆菌落，切勿直接从甘油菌、琼脂穿刺培养物或液体培养物中进行传代培养。通常，孵育 12-16 小时能获得较高的拷贝数，因为此时细菌刚刚进入稳定期，但细胞尚未开始死亡。

参考文献与相关资料

https://www.addgene.org/

DNA Cloning: A Personal View after 40 Years. Cohen, Stanley N. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110.39 (2013): 15521–15529 PubMed PMID: 24043817.

Cell Genetics and Hereditary Symbiosis Lederberg, Joshua. Physiological Reviews 32.4 (1952) 403-430.

Sex Compatibility in Escherichia Coli. Lederberg, Joshua, Luigi L. Cavalli, and Esther M. Lederberg. Genetics 37.6 (1952): 720–730. PubMed PMID: 17247418.

EPISOME-MEDIATED TRANSFER OF DRUG RESISTANCE IN ENTEROBACTERIACEAE VIII.: Six-Drug Resistance R Factor. Watanabe, Tsutomu, Chizuko Ogata, and Sachiko Sato. Journal of Bacteriology 88.4 (1964): 922–928. PubMed PMID: 14219055.

Transmissible Drug Resistance in an Epidemic Strain of Salmonella Typhimurium. Datta, Naomi. The Journal of Hygiene 60.3 (1962): 301–310. PubMed PMID: 14025218.

Construction of Biologically Functional Bacterial Plasmids In Vitro. Cohen, Stanley N. et al Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 70.11 (1973): 3240–3244. PubMed PMID: 1422013.

Uniform Nomenclature for Bacterial Plasmids: A Proposal. Novick, R P et al Bacteriological Reviews 40.1 (1976): 168–189. PubMed PMID: 16350226.

敬请关注灰藻生物，共筑健康未来！
— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

灰藻生物：我们期待着与客户共同成长，共创生命科学的美好未来！

更新日期：2026-06-23

编制人：磊子

审稿人：叶凡