分子实验笔记26:蛋白质免疫印迹（Western Blot）
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：17 发布时间：2026-06-23 17:26:11
引言
蛋白质免疫印迹是一种根据分子量大小分离蛋白质，随后利用针对目的蛋白的特异性抗体进行检测的技术。本方案概述了细胞裂解、测定裂解液中总蛋白浓度、预制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）以及免疫印迹的基本操作步骤。
图 1：蛋白质免疫印迹
一、一般指南
SDS-PAGE 凝胶中的丙烯酰胺浓度会有所不同。在进行高分子量蛋白质的免疫印迹时，应使用较低浓度的丙烯酰胺；在进行低分子量蛋白质的免疫印迹时，则应使用较高浓度的丙烯酰胺。
本方案使用的是干式转膜设备，但也可根据实际需要进行调整，以适应湿式或半干式转膜方法。
二、工作流程时间线
第 1 天：制备细胞裂解液，进行 SDS-PAGE 电泳，转膜，封闭，一抗孵育。
第 2 天：二抗孵育。
图 2：WB工作流程时间线
三、设备
o 微量离心机
o 单道移液枪：0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1000 µL
o 移液管控制器
o 移液枪吸头和移液管
o 分光光度计
o 金属浴
o 迷你电泳槽
o 电泳电源
o iBlot 2 凝胶转膜仪
o 滚轴
o 药匙
o 摇床
o 冷室
o 凝胶成像仪
o -80 °C 超低温冰箱
四、试剂
o 1X PBS
o 裂解缓冲液（如 RIPA 裂解液）
o 微量离心管
o BCA 蛋白定量试剂盒
o β-巯基乙醇
o 4X 蛋白上样缓冲液
o 预制 SDS-PAGE 凝胶
o SDS-PAGE 电泳缓冲液
o 预染蛋白分子量标准
o 乙醇
o iBlot 2 PVDF 迷你转膜叠片
o 20X TBS
o Tween-20
o 脱脂奶粉
o 96 孔微孔板
o 化学发光底物
o 保鲜膜
o 一抗
o 二抗
o 去离子水
五、实验前准备
请参考制造商的说明书，获取关于您所用抗体的具体信息，如理想的封闭缓冲液和最佳抗体浓度。建议通过梯度稀释来确定最佳抗体使用剂量。
二抗必须与一抗的宿主物种相匹配。例如，如果一抗是在小鼠体内制备的，则需使用抗小鼠的二抗。
图 3：注意选择合适的抗体
六、实验步骤
第一部分：细胞裂解
1. 在 100 x g 下离心 5 x 10⁶ 个细胞，离心 5 分钟。
2. 轻轻吸去上清液。
3. 将细胞沉淀重悬于 1 mL 1X PBS 中，并转移至微量离心管。
4. 在 100 x g 下离心 5 分钟。
5. 小心吸去上清液。
6. 用适量冰冷的裂解缓冲液重悬细胞沉淀。
专业提示：裂解缓冲液的体积取决于细胞沉淀的大小，但通常在 250–1000 µL 之间。
专业提示：理想的裂解缓冲液取决于目的蛋白在细胞内的定位。RIPA 缓冲液适用于大多数蛋白质，但对于难以提取的蛋白（如细胞核蛋白），可能需要更强烈的裂解缓冲液并结合超声破碎步骤。
7. 在冰上孵育 30 分钟。
8. 在 4 °C 下，以 14,000 x g 离心裂解液 15 分钟。
9. 将上清液转移至干净的微量离心管中。
10. 立即使用裂解液，或将其保存于 -80 °C 备用。
图 4：细胞裂解（图片展示为RIPA裂解液）
第二部分：测定总蛋白浓度并准备 SDS-PAGE 样品
11. 使用 Pierce BCA 蛋白定量试剂盒或其他首选方法测定蛋白浓度。：
o 1. 按 50:1 的比例将 BCA 试剂 A 与试剂 B 混合。
o 2. 将牛血清白蛋白（BSA）标准品进行系列稀释，浓度范围为 0–2000 µg/mL。
o 3. 在 96 孔微孔板中，将 10 µL 标准品、空白对照和裂解液样品分别以双复孔形式加入 200 µL BCA 工作液中。
o 4. 在 37 °C 下孵育 30 分钟。
o 5. 测定 590 nm 处的吸光度。
o 6. 计算板上双复孔样品的平均吸光度。
o 7. 从所有样品的吸光度中减去空白对照的平均吸光度。
o 8. 以 BSA 标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
o 9. 根据标准曲线推算样品的总蛋白浓度。
12. 计算每个样品需要加载的体积，以确保上样的总蛋白量一致。
专业提示：理想的上样总蛋白量因样品和目的蛋白而异，但通常在 10–50 µg 之间。如果目的蛋白在样品中丰度较低，则需要增加总蛋白的上样量。
13. 按以下步骤准备上样样品：
o 1. 在 4X 蛋白上样缓冲液中加入 10% (v/v) 的 β-巯基乙醇。
o 2. 将样品中的 4X 蛋白上样缓冲液稀释至 1X。
14. 将样品在 100 °C 下煮沸 10 分钟。
第三部分：SDS-PAGE 电泳
15. 按以下步骤准备预制凝胶：
o 1. 从塑料包装中取出凝胶。
o 2. 撕下封条并拔出塑料加样梳。
o 3. 用去离子水冲洗加样孔 3 次。
o 4. 每次洗涤之间轻轻甩动凝胶，以去除残留水分。
o 5. 将凝胶装入 SDS-PAGE 电泳槽中。
专业提示：不同的 SDS-PAGE 电泳槽对凝胶的放置方向要求不同，请参阅具体电泳槽的使用说明。
o 6. 合上固定夹。
16. 配制 1X 电泳缓冲液：将 25 mL 20X 电泳缓冲液用去离子水稀释至 500 mL，充分混匀。
17. 向 SDS-PAGE 电泳槽中加入 1X 电泳缓冲液。
18. 将样品加入凝胶的加样孔中。
19. 加入 5–10 µL 预染蛋白分子量标准。
20. 盖上电泳槽盖，并将电极线连接至电泳电源。
21. 在 100 V 电压下电泳 10–15 分钟，或直到样品移出加样孔进入凝胶中。
22. 将电压增加至 150 V，继续电泳直至获得理想的分离效果。
23. 用刮刀轻轻撬开凝胶板。
图 5：蛋白电泳上样
第四部分：干式转膜
24. 将凝胶浸泡在 20% 乙醇（去离子水配制）中 15 分钟。
（配制 20% 乙醇：将 2 mL 乙醇与 8 mL 去离子水混合均匀）
25. 按以下步骤组装转膜三明治：
o 1. 拆开 iBlot 2 PVDF 迷你转膜叠片的包装。
o 2. 将上层叠片放在一旁，丢弃白色隔离纸。
o 3. 将下层叠片保留在塑料托盘中。
o 4. 将下层叠片放置在转膜平台上。
o 5. 确保转膜平台上的电极触点与 iBlot 2 凝胶转膜仪对齐。
o 6. 将预跑过的凝胶在去离子水中润湿，然后放置在下层叠片的转印膜上。
o 7. 将一张 iBlot 滤纸在去离子水中浸湿。
o 8. 将浸湿的滤纸放在凝胶上，并用滚轴赶走气泡。
o 9. 将上层叠片覆盖在浸湿的滤纸上。
o 10. 使用滚轴赶走气泡。
o 11. 将吸水垫放在上层叠片上方，确保电极触点与 iBlot 2 转膜仪转膜平台上对应的电极触点对齐。
o 12. 合上转膜仪的盖子。
o 13. 选择所需的转膜程序，并确保参数正确。（对于分子量 <30 kDa 的蛋白，转膜 5–6 分钟；对于分子量 >150 kDa 的蛋白，转膜 8–10 分钟）
o 14. 点击“开始运行”。
26. 程序运行完成后，点击“完成”。
第五部分：封闭
27. 按以下步骤配制 1X TBST：混合 25 mL 20X TBS、2.5 mL Tween-20 和 472.5 mL 去离子水，充分混匀。
28. 按以下步骤配制封闭缓冲液：将 5% (w/v) 脱脂奶粉溶于 1X TBST 中。（例如：将 5 g 脱脂奶粉溶于 100 mL 1X TBST 中）
专业提示：理想的封闭缓冲液因抗体而异。在开始实验前，请参阅制造商的说明。
29. 从转膜仪中取出膜，将其放入装有 1X TBST 的容器中，蛋白面朝上。
30. 在室温下，于摇床上用封闭缓冲液封闭膜 1 小时。
31. 在室温下，于摇床上用 1X TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
第六部分：抗体孵育
32. 在封闭缓冲液中将一抗稀释至所需浓度。
专业提示：最佳抗体浓度因抗体而异，但通常在 1–10 μg/mL 之间。
33. 在 4 °C 下，于摇床上用一抗孵育膜过夜。
专业提示：一抗孵育时间可缩短至室温 2 小时，但这可能会导致更多的非特异性结合。
34. 在室温下，于摇床上用 1X TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
35. 在封闭缓冲液中将辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗稀释至所需浓度。
专业提示：最佳抗体浓度因抗体而异，但通常在 1–10 μg/mL 之间。
36. 在室温下，于摇床上用二抗孵育膜 60 分钟。
37. 在室温下，于摇床上用 1X TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。
38. 将化学发光底物 A 液和 B 液按 1:1 混合，配制化学发光工作液。
39. 在室温下，将膜置于化学发光工作液中轻轻孵育 5 分钟。
40. 用透明塑料膜覆盖，使用具备化学发光检测功能的凝胶成像仪或在暗室中检测条带。
图 6：WB显影结果展示（使用 α-微管蛋白抗体进行蛋白免疫印迹）
七、技巧与故障排除
o 最佳裂解缓冲液因样品类型和目的蛋白的细胞内定位而异。您可能需要尝试多种裂解缓冲液，以找到最适合您靶标的条件。
o 最佳抗体浓度和封闭缓冲液因抗体而异。在开始实验前，请查阅制造商的说明书，并考虑通过梯度稀释来确定最佳抗体使用剂量。
o 为了确保您的抗体既能按预期发挥作用又具有特异性，请包含一个已知表达该蛋白的阳性对照样品（例如，转染了目的蛋白的细胞），以及一个不表达该目的蛋白的阴性对照样品。
参考文献与相关资料
https://www.addgene.org/
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更新日期：2026-06-23
编制人：磊子
审稿人：叶凡