分子实验笔记25：重组抗体的转染(Transfection for Recombinant Antibodies)

引言

转染技术可实现目的基因在细胞培养中的瞬时表达。本方案描述了如何使用聚乙烯亚胺（PEI-MAX）作为转染试剂，将重组抗体质粒转染至悬浮型 HEK293 细胞中。转染并表达后，重组抗体可被纯化，用于多种应用。

图 1：细胞转染表达重组抗体

一、一般注意事项

o 对于含有 SV40 复制起点的抗体表达质粒，请使用稳定表达 SV40 大 T 抗原的 HEK293 细胞系。

o 对于含有 EB 病毒（Epstein-Barr virus）复制起点的抗体表达质粒，请使用稳定表达 EB 病毒核抗原（EBNA）的 HEK293 细胞系。

二、安全警告

HEK293 细胞属于生物安全二级（BSL-2）。请确保您遵守所在机构的生物安全规定。

图 2：生物安全

三、工作流程时间线

第 1 天：接种细胞

第 2 天：转染细胞

第 3-6 天：补料培养

第 7 天：收获抗体

四、设备

o 生物安全柜

o 4 °C 冰箱

o 微量移液枪及吸头

o 移液管控制器及移液管

o 兼容 50 mL 锥形管的台式离心机

o 自动细胞计数仪

o 37 °C、5% CO2 培养箱（配备 120 rpm 的摇床平台）

o 37 °C 水浴锅

o 涡旋振荡器

o 磁力搅拌子

o 磁力搅拌器

o pH 计

五、试剂

o HEK293 细胞

o 重组抗体质粒 DNA

o 500 mL 透气培养瓶

o 50 mL 锥形离心管

o 微量离心管

o 细胞计数板

o 30 mL 鲁尔锁注射器

o 0.2 µm 鲁尔锁过滤器

o 0.22 µm PES 过滤系统（1000 mL）

o 0.45 µm PES 过滤系统（500 mL）

o 台盼蓝（Trypan Blue）

o 丙戊酸钠盐（Valproic acid sodium salt）

o 聚乙烯亚胺盐酸盐（PEI-MAX，线性，转染级）

o 10% 泊洛沙姆 188（Poloxamer 188）

o 谷氨酰胺替代物（Glutagro）

o BalanCD HEK293 培养基

o BalanCD HEK293 补料（Feed）

o 苯甲脒（Benzamide）

o 抗痛素（Antipain）

o 亮肽素（Leupeptin）

o 抑肽酶盐水溶液（Aprotinin sapne solution）

六、实验前准备

o 使用前，将 DNA 和 PEI-MAX 工作液预热至室温，并将 BalanCD HEK293 转染培养基（BCD TFX）预热至 37 °C。其他试剂的配制说明见下文。

o 使用前，用 10% 次氯酸钠（漂白剂）擦拭所有移液器和设备表面。

七、试剂配制

o 100 mM 丙戊酸：将 2.88 g 丙戊酸溶解于 200 mL 去离子水中，通过 0.22 µm 无菌滤器过滤除菌，分装成 10 mL apquots，于 -20 °C 保存。

o 1 mg/mL PEI-MAX：在 1 L 瓶中加入 1 g PEI-MAX 粉末和 900 mL 去离子水，置于磁力搅拌器上搅拌，直至所有颗粒溶解。注意：粉末应迅速溶解（20 分钟内），但需检查溶液中是否仍有颗粒，如有则继续搅拌，可能需要数小时。用 10 N 氢氧化钠（NaOH）或 5 N 盐酸（HCl）调节 pH 至 7.0（注意：缓慢调节，每次加入的 NaOH 不超过 200 µL，或 HCl 不超过 20 µL）。用去离子水定容至 1 L，并再次检查 pH 是否发生漂移。通过 0.22 µm 滤器过滤，分装后于 -20 °C 保存备用。

o BCD TFX（转染培养基）：混合 1000 mL BalanCD HEK293 培养基、10 mL 10% 泊洛沙姆 188 和 40 mL 200 mM 谷氨酰胺替代物。不要添加选择性试剂。于 4 °C 保存，建议一个月后重新配制新鲜溶液。

o BCD Feed（补料液）：混合 500 mL BalanCD HEK293 补料和 20 mL 200 mM 谷氨酰胺替代物。于 4 °C 保存，建议一个月后重新配制新鲜溶液。

o 1000X 蛋白酶抑制剂混合物：混合 25 mg 亮肽素、50 mg 抗痛素、250 mg 苯甲脒和 25 mL 抑肽酶盐水溶液（2 mg/mL）。充分混匀后，通过 0.2 µm PES 注射器过滤器除菌。分装后于 -20 °C 直立冷冻保存。

八、实验步骤

第一部分：接种细胞

在转染前一天，在 500 mL 透气培养瓶中接种 108 mL HEK293 细胞悬液，细胞密度为 0.9 x 10⁶ 个细胞/mL。置于 37 °C、5% CO2 培养箱中，在 120 rpm 的摇床平台上孵育。

专业提示：请勿使用传代次数超过 30 代的细胞。

图 3：细胞培养

第二部分：转染

检查细胞密度和活力：

1. 使用 5 mL 移液管，将 0.5 mL HEK293 细胞悬液转移至干净的微量离心管中。

专业提示：细胞沉降迅速，取样前需重新悬浮。取样前请轻轻摇晃培养瓶 5-10 次。

2. 将 10 µL 台盼蓝转移至干净的微量离心管中。

3. 涡旋振荡细胞悬液。

4. 将 10 µL 细胞悬液转移至含有台盼蓝的微量离心管中。

5. 吹打 10 次混匀。

6. 将 10 µL 细胞悬液/台盼蓝混合物加载到细胞计数板上。

7. 将计数板放入自动细胞计数仪，测量活细胞密度和培养物活力。

专业提示：进行转染时，培养物的细胞密度应介于 1.5–2 x 10⁶ 个细胞/mL 之间，且活力需 >95%。

对含有 108 mL 细胞的培养瓶进行转染：

8. 将 6 mL BCD TFX 分别转移至两个 50 mL 离心管中。

9. 盖紧管盖，在 37 °C 水浴锅中孵育 1 小时。

10. 将 PEI-MAX 和重组抗体质粒 DNA 样品转移至生物安全柜中，在室温下孵育 1 小时。

11. BCD TFX 在水浴锅中预热后，将离心管转移至生物安全柜。

12. 向一管 6 mL BCD TFX 中加入 180 µg 重组抗体质粒 DNA。盖紧管盖，涡旋振荡 5 秒混匀。

13. 向另一管 6 mL BCD TFX 中加入 450 µL 1 mg/mL PEI-MAX（对于 1 mg/mL 的 PEI-MAX 母液，450 µg = 450 µL）。盖紧管盖，涡旋振荡 5 秒混匀。

专业提示：DNA 与 PEI 的最佳比例差异较大，应通过实验确定。典型比例范围为 1:1 至 1:6。

14. 将稀释后的 PEI-MAX 加入稀释后的 DNA 中。盖紧管盖，以 1 秒脉冲涡旋振荡 3 次。

15. 在室温下孵育 3 分钟。

16. 将 HEK293 细胞培养瓶转移至生物安全柜。

17. 将 12 mL PEI-MAX/DNA 混合物逐滴加入培养瓶中。

18. 盖紧培养瓶盖，轻轻摇晃 5-10 次混匀。

19. 将培养瓶放回培养箱。

图 4：细胞密度和培养物活力检测

第三部分：BCD 补料与丙戊酸添加

20. 在转染后 24–144 小时期间，向培养瓶中补充 4% 的 BCD Feed。

专业提示：补料操作最多可重复 4 次，补料液总体积不超过培养体积的 16%。

21. 在转染后 72-96 小时，向培养瓶中补充丙戊酸至终浓度 3.75 mM。

补料时间表示例：

o 周四：转染细胞。

o 周五（转染后 24 小时）：添加 4% BCD Feed。

o 周一（转染后 96 小时）：添加丙戊酸至 3.75 mM，添加 4% BCD Feed。

o 周二（转染后 120 小时）：添加 4% BCD Feed。

o 周三（转染后 144 小时）：添加 4% BCD Feed。

o 周四（转染后 168 小时）：收获抗体。

第四部分：收获抗体

在转染后 168 小时（1 周）收获抗体。

22. 将 HEK293 细胞及培养基转移至 50 mL 锥形离心管中。

23. 在 3100 x g 下离心 15 分钟，使细胞沉淀。

24. 使用 0.45 µm PES 过滤器过滤上清液。

25. 向上清液中加入 1X 蛋白酶抑制剂混合物。

26. 含有重组抗体的上清液可直接使用，也可进一步纯化重组抗体。

27. 将上清液于 4 °C 保存，直至使用。

图 5：抗体收集

参考文献与相关资料

https://www.addgene.org/

https://www.rapidnovor.com/

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更新日期：2026-06-23

编制人：磊子

审稿人：叶凡