分子实验笔记24：免疫细胞化学(Immunocytochemistry)

一、引言

免疫细胞化学是一种利用抗体检测细胞中抗原的技术。本文介绍了在培养细胞中，使用针对靶蛋白的一抗和荧光二抗进行细胞固定和标记的基本步骤。本方案概述了使用甲醛固定法对 HeLa 细胞进行靶蛋白固定和标记的步骤。针对不同的细胞、靶蛋白等，本方案可能需要进行相应的优化。

图 1：免疫细胞化学

二、工作流程时间线

第 1 天：接种细胞

>第 3-4 天：固定和标记细胞

三、设备

o 移液管控制器

o 移液枪吸头和移液枪

o 摇床

o 镊子

o 荧光显微镜

o 单道移液枪：0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1000 µL

四、试剂

o 1X PBS

o 微量离心管

o 无菌多聚-D-赖氨酸包被的盖玻片

o HeLa 细胞

o 24 孔板

o 4% 多聚甲醛

o 5 mg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）

o 牛血清白蛋白（BSA）

o Triton X-100

o 一抗

o 二抗

o 去离子水

o 显微镜载玻片

o 抗荧光淬灭封片剂

o 实验室无尘擦拭纸

o 15 mL 锥形离心管

o 50 mL 锥形离心管

五、实验前准备

请参考制造商的说明书，获取关于您所用抗体的具体信息，如抗体浓度、孵育时间和推荐的兼容试剂。

二抗必须与一抗的宿主物种相匹配。例如，如果一抗是在小鼠体内制备的，则需使用抗小鼠的二抗。

图 2：抗体选择

六、试剂配制

o 通透缓冲液：在 10 mL PBS 中稀释 20 µL Triton X-100。

o 封闭缓冲液：在 10 mL PBS 中稀释 0.5 g BSA 和 30 µL Triton X-100。

o 抗体稀释缓冲液：在 50 mL PBS 中稀释 0.5 g BSA 和 150 µL Triton X-100。

o 300 nM DAPI 工作液：

配制 300 µM DAPI 母液：将 2.1 µL 的 5 mg/mL DAPI 溶液稀释至 100 µL PBS 中。注意避光保存。

配制 300 nM DAPI 工作液：将 5 µL 的 300 µM DAPI 母液稀释至 5 mL PBS 中。注意避光保存。

七、实验步骤

第一部分：接种细胞

图 3：接种细胞

1. 在 24 孔细胞培养板的每个孔中放入一张无菌多聚-D-赖氨酸包被的盖玻片。

2. 每孔接种 5 x 10³ 个 HeLa 细胞。

3. 在标记前，让 HeLa 细胞生长至所需密度。

第二部分：固定和通透细胞

图 4：4% 多聚甲醛用于细胞固定

4. 轻轻吸出 24 孔板中的培养基。

5. 用 500 µL PBS 洗涤每个孔，吸出洗涤液，并将其丢弃在适当的废液容器中。

6. 在冰上，用 500 µL 冰冷的 4% 多聚甲醛（溶于 PBS）固定每个孔，孵育 15 分钟。

专业提示：虽然 4% 多聚甲醛固定法对许多靶蛋白效果良好，但它可能并不适用于所有情况。对于某些应用，甲醇或丙酮等替代固定方法可能效果更好。

7. 去除多聚甲醛，并按照您所在机构的实验室安全指南，将其丢弃在适当的废液容器中。

8. 在摇床上用 500 µL PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

9. 在室温下，用 500 µL 通透缓冲液在摇床上通透细胞 10 分钟。

10. 去除通透缓冲液，并将其丢弃在适当的废液容器中。

11. 在摇床上用 500 µL PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

第三部分：抗体标记

图 5：抗体标记

12. 在室温下，用 500 µL 封闭缓冲液在摇床上封闭 20 分钟。

13. 去除封闭缓冲液，并将其丢弃在适当的废液容器中。

14. 在抗体稀释缓冲液中，将一抗稀释至所需浓度。

专业提示：最佳抗体浓度会有所不同，但通常在 1-10 µg/mL 之间。

15. 向孔中加入 500 µL 稀释后的一抗，在室温下孵育 2 小时。

16. 去除一抗，并将其丢弃在适当的废液容器中。

17. 在摇床上用 500 µL PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

18. 在抗体稀释缓冲液中，将荧光标记的二抗稀释至所需浓度。

专业提示：最佳抗体浓度会有所不同，但通常在 1-10 µg/mL 之间。

19. 向孔中加入 500 µL 荧光标记的二抗，在室温下避光孵育 30 分钟。

专业提示：可以用铝箔纸包裹孔板以避光。

20. 去除二抗，并将其丢弃在适当的废液容器中。

21. 在摇床上用 500 µL PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

22. （可选）在室温下避光，用 500 µL 300 nM DAPI 工作液复染细胞核 10 分钟。

23. 去除 DAPI，并将其丢弃在适当的废液容器中。

24. 在摇床上用 500 µL PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

25. 用镊子轻轻取出盖玻片。

26. 用实验室无尘擦拭纸吸干盖玻片上的多余液体。

27. 在显微镜载玻片上滴加 1 滴抗荧光淬灭封片剂。

28. 将盖玻片轻轻盖在载玻片上，使有细胞的一面朝下。

29. 在带有合适荧光滤光片的显微镜下观察细胞标记情况。

八、技巧与故障排除

o 最佳固定方法将因样品类型和感兴趣的蛋白而异。您可能需要尝试多种固定方法，以找到最适合您靶标的条件。

o 最佳抗体浓度会因抗体而异。在开始实验前，请查阅制造商的说明书，并考虑通过梯度稀释来确定最佳剂量。

o 为了确保您的抗体既能按预期发挥作用又具有特异性，请包含一个已知表达该蛋白的阳性对照样品（例如，转染了表达该靶蛋白质粒的细胞），以及一个不表达该靶蛋白的阴性对照样品。

参考文献与相关资料

https://www.addgene.org/

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更新日期：2026-05-29

编制人：磊子

审稿人：叶凡