分子实验笔记23：重组抗体的考马斯亮蓝纯度染色分析(Coomassie Purity Stain of Recombinant Antibodies)

一、引言

本方案描述了如何使用即用型生物安全考马斯亮蓝 G-250 染色剂和 ImageJ 软件来测定重组抗体的纯度和浓度。样品通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）与已知浓度标准抗体的连续稀释液一同分离。在用考马斯亮蓝染色后，使用 ImageJ 软件测量蛋白条带的强度并生成标准曲线，从而确定样品中抗体蛋白含量与总蛋白含量的比例。

二、工作流程时间线

第 1 天：进行 SDS-PAGE 并染色凝胶

第 1 天或之后：图像分析

三、设备

o 加热模块/金属浴

o 单道移液枪：1–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1000 µL

o 移液管控制器

o 微量离心机

o 电泳槽

o 电源

o 摇床

o 通风橱

o 金属铲刀

o 刀片

o 塑料托盘

o 凝胶成像系统

o ImageJ 或类似图像分析软件

四、试剂

o 纯化重组抗体（0.9–1.1 mg/mL）

o SimplyBlue SafeStain（赛默飞，LC6060）

o 4-12% NuPage Novex bis-tris 迷你胶（1mm 厚，10 孔）

o 20X MOPS SDS 电泳缓冲液

o 4X NuPage 上样缓冲液

o 10X NuPage 样品还原剂（500 mM 二硫苏糖醇, DTT）

o PageRuler Plus 预染蛋白 Marker

o 移液枪吸头：10 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL

o 移液管：5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL

o 凝胶上样吸头

o 微量离心管

o PBS (1X, pH 7.4)

o 250 mL 无菌瓶

o 去离子水

o IgG 同型标准品 2.5 mg/mL（可使用商业标准品或验证过的内部标准品）

五、实验前准备

将加热模块预热至 100 °C。

在冰上解冻 IgG 标准品和预染蛋白 Marker。

六、试剂配制

1. 配制 IgG 标准品

o 用 PBS 稀释 2.5 mg/mL 的 IgG 同型标准品，配制如下浓度：

1.5 mg/mL：18 µL 的 2.5 mg/mL 标准品 + 12 µL PBS

1.0 mg/mL：20 µL 的 1.5 mg/mL 标准品 + 10 µL PBS

0.75 mg/mL：15 µL 的 1.0 mg/mL 标准品 + 5 µL PBS

0.5 mg/mL：13.3 µL 的 0.75 mg/mL 标准品 + 6.7 µL PBS

0.25 mg/mL：10 µL 的 0.5 mg/mL 标准品 + 10 µL PBS

0.125 mg/mL：10 µL 的 0.25 mg/mL 标准品 + 10 µL PBS

o 将 5 µL 的每种标准品转移至微量离心管中。

o 加入 8 µL PBS，使总体积达到 13 µL。

2. 配制重组抗体样品

o 将纯化的重组抗体稀释或浓缩至 0.9–1.1 mg/mL。

o 将 5 µL 重组抗体转移至微量离心管中。

o 加入 8 µL PBS，使总体积达到 13 µL。

3. 配制 1X MOPS 缓冲液

o 将 25 mL 的 20X MOPS 缓冲液加入 475 mL 去离子水中稀释。

o 轻轻颠倒混匀。

七、实验步骤

第一部分：SDS-PAGE 电泳

1. 向每个样品中加入 5 µL 的 4X 上样缓冲液。

2. 向每个样品中加入 2 µL 的 10X 还原剂。

3. 在微量离心机中短暂离心样品。

4. 在 100 °C 的加热模块中加热样品 10 分钟。

5. 在微量离心机中短暂离心样品。

6. 从塑料包装中取出凝胶，用去离子水冲洗。

7. 轻轻撕掉凝胶底部的白色贴纸。

8. 将凝胶放入电泳槽并固定好。

专业提示：如果不确定凝胶的正确方向，请查阅制造商的说明书。

9. 小心地从凝胶中拔出梳子。

10. 用 200 µL 的 1X MOPS 电泳缓冲液冲洗每个加样孔。

11. 向电泳槽中加满 1X MOPS 电泳缓冲液。

12. 确保电泳槽密封良好。

13. 向相应的孔中加入 5 µL 预染蛋白 Marker。

专业提示：如果可能，在上样样品前空出一个泳道。

14. 向相应的孔中加入 20 µL 的每种重组抗体样品。

专业提示：在样品之间留出清晰的空泳道将使凝胶定量更容易。

15. 盖上电泳槽盖子并连接电源。

16. 在 150 V 电压下电泳 1 小时。

专业提示：如果样品跑得不均匀且染料前沿看起来像“笑脸”，请降低电压。

17. 关闭电源并拔掉电泳槽插头。

18. 从电泳槽中取出凝胶。

19. 使用金属铲刀轻轻撬开凝胶夹板。

20. 使用刀片切掉顶部的加样孔部分和底部可见染料的凝胶部分。

第二部分：凝胶染色

21. 将凝胶放入装有 100 mL 去离子水的塑料托盘中。

22. 在摇床上轻轻晃动，用去离子水冲洗凝胶 5 分钟。

23. 将水倒入水槽倒掉。

24. 加入 20 mL SimplyBlue SafeStain 染色液，在摇床上轻轻晃动孵育 1 小时。

25. 将染色液倒入水槽倒掉。

26. 加入 100 mL 去离子水，在摇床上轻轻晃动孵育 1 小时。

27. 将水倒入水槽倒掉。

28. 加入 100 mL 去离子水，在摇床上轻轻晃动孵育 1 小时。

29. 将水倒入水槽倒掉。

30. 使用合适的成像系统拍摄凝胶的明场图像。

图 1：凝胶染色示例

重组抗体制备样品应在约 50 kDa 和 25 kDa 处有两条清晰的条带，分别对应重链（HC）和轻链（LC）蛋白。背景染色应非常少。

专业提示：条带电泳迁移率发生较大偏移（如图 1 中的样品 AR0016）表明样品在细胞内可能未被正确处理（例如，未能切除信号肽），可能不具备功能。该样品将无法通过质检，因此不予使用。

第三部分：图像分析

31. 使用 ImageJ 或类似的图像软件确定蛋白条带相对于整个泳道的相对强度。

32. 将凝胶图像导入 ImageJ：选择 File（文件） -> Open（打开） -> 选择文件位置。

33. 将图像类型更改为 8-bit（8位）：选择 Image（图像） -> Type（类型） -> 8-bit。

34. 确定凝胶的每个泳道（如图 2 所示）：

图 2：图像分析示例1

o 使用矩形工具，在第一个凝胶泳道周围画一个框。

o 选择 Analyze（分析） -> Gels（凝胶分析） -> Select First Lane（选择第一泳道）。

o 将框拖动到下一个泳道。

o 选择 Analyze（分析） -> Gels（凝胶分析） -> Select Next Lane（选择下一泳道）。

o 对所有泳道重复此操作。

35. 绘制蛋白条带的峰下面积曲线（如图 3 所示）：

图 3：图像分析示例2

o 选择 Analyze（分析） -> Gels（凝胶分析） -> Plot Lanes（绘制泳道曲线）。

36. 每个泳道将出现一个图表，其中的峰值代表每个蛋白条带。

37. 使用直线工具连接每个峰的底部。

38. 选择魔棒工具。

39. 通过选择每个峰的中心来填充每个峰。

40. 将结果导出为 csv 文件：在结果表中，选择 File（文件） -> Save As（另存为）。

41. 计算样品的纯度百分比：

图 4：计算样品的纯度百分比公式

其中：P = 纯度 (%)；H = 重链（HC）峰面积；L = 轻链（LC）峰面积；A = 泳道中所有条带的总面积

如AR0018 样品示例（图 1 中的泳道 2）：

纯度 = (HC + LC 面积) / 总面积 × 100% = 96.887%

专业提示：以上为仅使用纯度 ≥90% 的重组抗体制备样品，但有些实验室常规使用未纯化的组织培养上清液也未出现任何问题。

42. 在电子表格软件中，绘制 IgG 标准品的 mg/mL 浓度与 HC + LC 面积的关系图：

o 打开导出的 CSV 文件并导入数据。

o 选择“插入”选项卡，然后点击“图表”。

o 在图表编辑器中，将图表类型选择为“散点图”。

o 更改数据范围，选择代表 X 轴和 Y 轴的单元格。

43. 为标准品添加线性趋势线：

o 在图表编辑器中，选择“自定义”选项卡。

o 选择“系列”下拉菜单。

o 勾选“趋势线”复选框。

44. 确定趋势线的线性方程和 R² 值：

o 在“自定义”选项卡中，选择“标签”下拉菜单并选择“使用方程”。

o 勾选“显示 R²”复选框。

专业提示：趋势线的 R² 值应介于 0.95 到 1 之间。

45. 使用趋势线方程根据样品的 HC + LC 面积确定样品的浓度。

o 计算示例：

如果样品的 HC + LC 面积为 18179.442，标准曲线的线性方程为 y = 14725x + 3748.4，则将 18179.442 代入 y 并求解 x。

18179.442 = 14725x + 3748.4

x = 0.980

该样品的浓度为 0.980 mg/mL。

参考文献与相关资料

https://www.addgene.org/

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更新日期：2026-05-29

编制人：磊子

审稿人：叶凡