分子实验笔记22：利用间接 ELISA法进行抗体验证(Antibody Validation Using the Indirect ELISA Method)

一、引言

本方案描述了如何通过针对纯化抗原进行间接酶联免疫吸附测定来验证抗体。本方案还将说明如何利用已知浓度的抗原建立标准曲线，以及如何用针对靶标的抗体进行探针检测以展示剂量反应。

图 1：酶联免疫吸附测定（Elisa实验）

二、一般注意事项

整个酶联免疫吸附测定可以在一天内完成，也可以通过在 4°C 而不是室温或 37°C 下孵育某些步骤，将其拆分到几天内完成。本方案会在有不同孵育选项时进行注明。

注意事项：请在通风良好的区域使用终止液，并避免吸入其挥发的气体。

图 2：生物安全

三、工作流程时间线

第 1 天：抗原包被

第 2 天：封闭

第 3 天：一抗孵育

第 4 天：二抗孵育与读板

图 3：间接法Elisa实验流程

四、技巧与故障排除

一抗的最佳使用浓度会有所不同，需要通过实验经验来确定。如果条件允许，建议先进行初步测试，使用连续稀释的一抗来确定最适合您实验的浓度。

洗涤步骤可以手动完成，但如果有条件，建议使用自动洗板机。

五、设备

o 适配 96 孔板的酶标仪/分光光度计

o 单道移液枪：1–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1000 µL

o 多道移液枪：20–200 µL

o 多道移液枪配套试剂槽

o 移液管控制器

o 微量离心机

o 微孔板振荡器

o 洗板机（可选）

o 电子天平

o Microsoft Excel 或类似数据分析软件

六、试剂

o 纯化抗原

o 纯化重组抗体

o 同型对照抗体

o HRP 标记的种属特异性二抗

o EPSA 96 孔微孔板（如 Corning 9018）

o 牛血清白蛋白（BSA）

o 50 mL 离心管

o 96 孔聚酯（透明）微孔板封板膜

o 微量离心管

o 移液枪吸头：1000 µL, 10 µL, 200 µL, 20 µL

o 移液管：10 mL

o 1 L 聚苯乙烯瓶

o PBS (1X, pH 7.4)

o TMB 底物试剂盒

o Tween-20

o 铝箔纸

图 4：TMB试剂

七、实验前准备

将所有试剂预热至室温。

八、实验步骤

第一部分：制备抗原标准品并包被微孔板

1. 在微量离心管中将纯化抗原稀释至 20 ng/µL 并涡旋混匀。

专业提示：您可能需要尝试几种不同的抗原浓度来确定最佳浓度。

2. 按如下方式制备纯化抗原的连续稀释液：

o 2 ng/µL：在微量离心管中加入 100 µL 的 20 ng/µL 母液到 900 µL PBS 中，涡旋混匀。

o 1 ng/µL：加入 450 µL 的 2 ng/µL 母液到 450 µL PBS 中，涡旋混匀。

o 0.5 ng/µL：加入 450 µL 的 1 ng/µL 母液到 450 µL PBS 中，涡旋混匀。

o 0.25 ng/µL：加入 450 µL 的 0.5 ng/µL 母液到 450 µL PBS 中，涡旋混匀。

o 0.125 ng/µL：加入 450 µL 的 0.25 ng/µL 母液到 450 µL PBS 中，涡旋混匀。

o 0 ng/µL：仅使用 450 µL PBS（作为空白对照）。

3. 使用多道移液枪，将 50 µL 溶液加入 96 孔 ELISA 微孔板每一行的前三个孔中，每一行使用不同的标准品溶液。

4. 用 96 孔板封板膜覆盖微孔板，并在 37 °C 下孵育 30 分钟，或在 4 °C 下孵育过夜。

第二部分：封闭微孔板

5. 按如下方式配制洗涤缓冲液（含 0.05% Tween-20 的 PBS）：

将 0.5 mL Tween-20 加入 999.5 mL 1X PBS 中。

6. 盖紧瓶盖并反复倒置数次以混匀。

7. 小心地从 96 孔板上揭下封板膜并放在一旁。

8. 吸干孔中的液体，并使用多道移液枪向每个孔中加入 200 µL 洗涤缓冲液。

专业提示：洗涤可以手动完成，但如果有条件，建议使用自动洗板机。

9. 封板。

10. 将微孔板置于设定为 400 rpm 的微孔板振荡器上，振荡 1 分钟。

11. 重复步骤 8–10 两次，总共洗涤三次。

12. 最后一次洗涤后，吸干孔中的洗涤缓冲液。

13. 按如下方式配制封闭缓冲液（含 1% BSA 的 PBS）：

o 将 250 mg BSA 加入 25 mL PBS 中。

14. 盖紧管盖并反复倒置数次以混匀。

15. 使用多道移液枪，向每个孔中加入 200 µL 封闭缓冲液。

16. 用封板膜覆盖微孔板，并在设定为 400 rpm 的微孔板振荡器上，室温孵育 2 小时或在 4 °C 下孵育过夜。

第三部分：一抗孵育

17. 小心地从 96 孔板上揭下封板膜并放在一旁。

18. 吸干孔中的液体，并使用多道移液枪向每个孔中加入 200 µL 洗涤缓冲液。

19. 封板。

20. 将微孔板置于设定为 400 rpm 的微孔板振荡器上，振荡 1 分钟。

21. 重复步骤 18–20 两次，总共洗涤三次。

22. 最后一次洗涤后，吸干孔中的洗涤缓冲液。

23. 按如下方式配制抗体稀释缓冲液（含 0.1% BSA 的 PBS）：

o 将 50 mg BSA 稀释到 50 mL PBS 中。

24. 盖紧管盖并反复倒置数次以混匀。

25. 在抗体稀释缓冲液中，将一抗和同型对照抗体稀释至所需浓度。

专业提示：理想的抗体浓度会有所不同，需要通过实验经验来确定。我们建议从 1–10 µg/mL 之间的三个浓度开始尝试。

26. 盖紧管盖并反复倒置数次以混匀。

27. 使用多道移液枪，向相应的孔中加入 100 µL 一抗溶液。

28. 用封板膜覆盖微孔板，并在设定为 400 rpm 的微孔板振荡器上，室温孵育 2 小时或在 4 °C 下孵育过夜。

第四部分：二抗孵育

29. 小心地从 96 孔板上揭下封板膜并放在一旁。

30. 吸干孔中的液体，并使用多道移液枪向每个孔中加入 200 µL 洗涤缓冲液。

31. 封板。

32. 将微孔板置于设定为 400 rpm 的微孔板振荡器上，振荡 1 分钟。

33. 重复步骤 30–32 两次，总共洗涤三次。

34. 最后一次洗涤后，吸干孔中的洗涤缓冲液。

35. 在抗体稀释缓冲液中，将 HRP 标记的种属特异性二抗稀释至所需浓度。

36. 盖紧管盖并反复倒置数次以混匀。

37. 使用多道移液枪，向每个孔中加入 100 µL 二抗。

38. 用封板膜覆盖微孔板，并在设定为 400 rpm 的微孔板振荡器上，室温孵育 2 小时或在 4 °C 下孵育过夜。

第五部分：TMB 显色反应

39. 小心地从 96 孔板上揭下封板膜并放在一旁。

40. 吸干孔中的液体，并使用多道移液枪向每个孔中加入 200 µL 洗涤缓冲液。

40. 封板。

40. 将微孔板置于设定为 400 rpm 的微孔板振荡器上，振荡 1 分钟。

40. 重复步骤 40–42 两次，总共洗涤三次。

40. 最后一次洗涤后，吸干孔中的洗涤缓冲液。

40. 使用前立即混合 TMB 底物试剂盒中的 5 mL TMB 溶液和 5 mL 过氧化物溶液。

40. 盖紧管盖并反复倒置数次以混匀。

40. 使用多道移液枪，向每个孔中加入 100 µL TMB/过氧化物混合液。

40. 用封板膜覆盖微孔板，并用铝箔纸包裹避光。

40. 将微孔板在室温下置于设定为 400 rpm 的微孔板振荡器上，孵育 15–30 分钟。

专业提示：定期检查微孔板以确定何时出现所需的颜色变化。颜色将从黄色变为蓝色，通常需要 15 到 30 分钟。高浓度的 HRP 会产生淡绿色溶液。在任何孔显示绿色产物之前停止反应。出现沉淀产物表明 HRP 过多，需要优化实验条件。

40. 当出现所需的颜色变化时，轻轻揭下封板膜。

40. 使用多道移液枪，直接向孔中加入 100 µL TMB 终止液以停止反应。

40. 在分光光度计上测量每个孔在 450 nm 处的吸光度。使用分光光度计生成标准曲线。

专业提示：如果您没有看到任何颜色变化或剂量反应，您的抗体浓度可能太低。在这种情况下，请使用更高的抗体浓度。如果反应饱和且您没有看到任何剂量反应，您的抗体浓度可能太高。在这种情况下，请使用较低的抗体浓度。标准曲线的理想范围因靶标而异，需要通过实验经验来确定。第一部分第 2 步中创建的稀释系列是一个建议的起始点。如果您的未知样品的吸光度高于标准曲线的范围，您将需要在标准曲线中包含更高的浓度或稀释未知样品（计算原始样品浓度时不要忘记考虑该稀释倍数！）。

样本数据

图 5：微孔板用连续稀释的人重组纯化结蛋白（蓝色）或阴性对照蛋白载脂蛋白 L3（红色）过夜包被，封闭后，与 Anti-Desmin [D7] 过夜孵育。微孔板与 HRP 标记的抗人 IgG 二抗孵育 2 小时，与 TMB 底物反应，并在 15 分钟后停止反应。在 450 nm 处读取吸光度，并针对加载的抗原微克数作图。

参考文献与相关资料

https://www.addgene.org/

敬请关注灰藻生物，共筑健康未来！
— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

灰藻生物：我们期待着与客户共同成长，共创生命科学的美好未来！

更新日期：2026-05-28

编制人：磊子

审稿人：叶凡