分子实验笔记21：利用Protein A或Protein G进行重组抗体亲和纯化(Recombinant Antibody Affinity Purification with Protein A or Protein G)

一、 引言

本方案描述了如何使用 Protein A 或 Protein G 层析柱从细胞培养上清液中亲和纯化重组抗体。

二、 安全警告

叠氮化钠（Sodium azide）具有毒性。操作时请穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、护目镜和手套。含有叠氮化钠的废液应按照贵机构的危险废弃物处理程序进行妥善处置。

图 1：生物安全

三、 工作流程时间线

第 1 天：纯化抗体

第 2 天或之后：缓冲液置换

四、 设备

o II 级 A2 型生物安全柜

o 4 °C 冰箱

o 移液管控制器

o 适配 50 mL 离心管的台式离心机

o NanoDrop 分光光度计

o 37 °C, 5% CO2 培养箱（带 120 rpm 摇床平台）

o 37 °C 水浴锅

o 铁架台和夹具

o 高压灭菌锅

o 单道移液枪：0.1–1 mL, 20–200 µL, 2–20 µL, 0.5–10 µL

图 2：设备展示

五、 试剂与耗材

注：以下列出了原文中提到的具体耗材型号，实际使用时可替换为同等规格产品。

o 吸液管及不同规格移液管 (5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)

o 50 mL 离心管

o 微量离心管

o 0.2 µm PES 过滤系统

o 磷酸二氢钠一水合物

o 磷酸氢二钠

o 1 M Trizma 盐酸溶液 pH 9.0

o 250 mL 无菌瓶

o 0.45 µm PES 完整过滤装置 (500 mL)

o 注射器 (30 mL) 及 0.2 µm 滤器 (Luer-lock)

o IgG 洗脱缓冲液 (如 Thermo Fisher 21028)

o Protein G GraviTrap 层析柱 或 rProtein A GraviTrap 层析柱 (Cytiva)

o LabMate PD10 缓冲液储液槽

o 5% 叠氮化钠

o PBS (1X, pH 7.4)

o 蛋白酶抑制剂：Benzamide, Antipain, Leupeptin, Aprotinin

o Zeba Spin 脱盐柱 (7 kDa MWCO)

o Amicon Ultra-15 超滤管 (30 kDa MWCO)

o 50 mL LoBind 低吸附管

六、 实验前准备

使用前用 10% 漂白剂擦拭所有移液枪和设备。

使用前将亲和层析柱、结合缓冲液和洗脱缓冲液预热至室温。

七、 试剂配制

1 M 磷酸二氢钠一水合物 (NaH₂PO₄·H₂O), pH 7.0

o 138 g NaH₂PO₄·H₂O

o 1 L 去离子水

o 调节 pH 至 7.0，高压灭菌或过滤除菌。

1 M 磷酸氢二钠 (Na₂HPO₄), pH 7.0

o 142 g Na₂HPO₄

o 1 L 去离子水

o 调节 pH 至 7.0，高压灭菌或过滤除菌。

1 M 磷酸钠缓冲液, pH 7.0

o 390 mL 无菌磷酸二氢钠一水合物溶液

o 610 mL 无菌磷酸氢二钠溶液

o 调节 pH 至 7.0，4 °C 可保存 1 个月。

Protein A/G 结合缓冲液 (20 mM 磷酸钠缓冲液, pH 7.0)

o 20 mL 1 M 磷酸钠缓冲液

o 980 mL 去离子水

o 调节 pH 至 7.0，高压灭菌或过滤除菌。

1000X 蛋白酶抑制剂混合液

o 25 mg Leupeptin

o 50 mg Antipain

o 250 mg Benzamidine

o 25 mL Aprotinin (2 mg/mL)

o 充分混合并通过 0.2 µm PES 滤器除菌。分装后 -20 °C 直立冷冻保存。

八、 实验步骤

第一部分：亲和层析

1. 将含有重组抗体的过滤后组织培养上清液平衡至室温。

专业提示：如果尚未添加，请加入蛋白酶抑制剂至 1X 浓度。我们通常从约 250 mL 上清液开始，并加入 250 µL 的 1000X 蛋白酶抑制剂混合液。

2. 加入 1 份 Protein A/G 结合缓冲液到 1 份组织培养上清液中，充分混匀。

3. 打开 Protein G GraviTrap 或 rProtein A GraviTrap 层析柱的盖子，轻轻倒掉乙醇储存液。

4. 将 LabMate PD10 缓冲液储液槽紧密连接到 GraviTrap 层析柱的顶部。

专业提示：GraviTrap 层析柱的结合载量是有限的。如果您的样品超过了载量，请将样品分配到多个层析柱中。有关总结合载量的信息，请参阅制造商说明书。

5. 将 GraviTrap 层析柱固定在铁架台的夹具上。

6. 用剪刀在层析柱底部的压痕处剪开尖端。

7. 用 10 mL 室温 Protein A/G 结合缓冲液平衡层析柱。

8. 收集流穿液至 50 mL 离心管中，使用后丢弃。

9. 小心地将过滤并稀释后的细胞培养上清液倒入 GraviTrap 层析柱中。

10. 将流穿液收集在 250 mL 瓶子中。

11. 重复步骤 9–10，使上清液总共通过层析柱 2 次。

专业提示：这将确保上清液中的重组抗体被耗尽（即被柱子充分结合）。

12. 用 25 mL Protein A/G 结合缓冲液清洗层析柱 2 次。

13. 向 10 个微量离心管中各加入 50 µL 的 1 M Trizma 盐酸溶液 (pH 9.0)。

14. 盖紧 GraviTrap 层析柱底部的盖子。

15. 向盖好底部的 GraviTrap 层析柱中加入 5 mL Pierce IgG 洗脱缓冲液，室温孵育 10 分钟。

16. 打开层析柱盖子，收集 500 µL 的组分到装有 50 µL 1 M Trizma 盐酸溶液 (pH 9.0) 的试管中。

注：Trizma 用于中和洗脱液的酸性。

17. 盖紧试管盖子，涡旋震荡 5 秒混匀。

18. 使用 NanoDrop 分光光度计的 A280 IgG 模式测定每个组分的蛋白浓度。

图 3：使用 NanoDrop测定蛋白浓度

19. 合并所有测得蛋白含量的洗脱液。

20. 使用 NanoDrop 测定合并后样品的蛋白浓度。

21. 如果合并样品的浓度高于 1.0 mg/mL，请转至 选项 1，使用 Zeba Spin 7 kDa 脱盐柱进行缓冲液置换。

22. 如果合并样品的浓度低于 1.0 mg/mL，请转至 选项 2，使用 Amicon 30 kDa 超滤管进行缓冲液置换/浓缩。

23. （可选）通过用 25 mL Protein A/G 结合缓冲液清洗来再生层析柱，并将其保存在 20% 乙醇中，置于 4 °C。

专业提示：当纯化同一种重组抗体时，层析柱可重复使用多达 5 次。

第二部分：缓冲液置换

根据上述合并样品的浓度选择选项 1 或选项 2。

选项 1：使用脱盐柱进行缓冲液置换

24. 10 mL Zeba Spin 脱盐柱最多可容纳 4 mL 重组抗体样品。

专业提示：如果样品体积大于 4 mL，请将其分配到 2 个柱子中。

25. 拧下 10 mL Zeba Spin 脱盐柱的底部塞子并松开盖子。

26. 将柱子放入 50 mL 收集管中。

27. 以 1000 x g 离心 2 分钟以去除储存液。

28. 在柱子侧面标记压实树脂倾斜向上的位置。在随后的所有离心步骤中，将柱子放入离心机时使标记朝外。

专业提示：离心后树脂会显得压实。

29. 将流穿液丢弃到废液容器中。

30. 向柱中加入 5 mL PBS。

31. 以 1000 x g 离心 2 分钟以去除 PBS。

32. 重复步骤 30–31 共 3 次，每次都要丢弃收集管中的缓冲液。

33. 将柱子放入一个新的 50 mL LoBind 收集管中。

34. 缓慢地将样品加样到压实树脂床的中心。

专业提示：对于体积 < 1.5 mL 的样品，可加入 0.2 mL PBS 补满，以帮助蛋白回收。

35. 让树脂床完全吸收样品。

36. 以 1000 x g 离心 2 分钟以收集样品。

37. 使用后丢弃柱子。

38. 在 NanoDrop 上测定抗体浓度。

39. 如有需要，用 PBS 将抗体稀释至 1 mg/mL。

40. 为了长期保存，加入无菌叠氮化钠至 1 mM 终浓度。

选项 2：使用 Amicon 柱进行缓冲液置换和浓缩

24. 向 Amicon Ultra-15 30 kDa 柱的储液槽中加入 15 mL PBS。

25. 室温孵育 10 分钟。

26. 以 3100 x g 离心 8 分钟。

27. 将流穿液丢弃到废液容器中。

28. 将重组抗体样品加入柱子的储液槽中。

29. 用 PBS 填满柱子的剩余空间，并反复吹吸几次以混匀。

30. 以 3100 x g 离心 8 分钟。

31. 将流穿液丢弃到废液容器中。

32. 重复步骤 29-31 至少 4 次，以确保充分的缓冲液置换。

33. 将流穿液丢弃到废液容器中。

34. 用 PBS 填满柱子的剩余空间，并反复吹吸几次以混匀。

35. 以 3100 x g 离心 8 分钟。

36. 从滤器储液槽中取出少量样品，在 NanoDrop 上检查浓度，看样品是否达到所需浓度。

37. 如果样品浓度仍然过低，请重复离心，直到样品体积减少到足以达到所需浓度。

专业提示：定期检查 NanoDrop 上的浓度，看样品是否达到所需浓度。

38. 轻轻地将样品从储液槽转移到 LoBind 管中。

专业提示：不要用枪头刮擦滤膜。

39. 在 NanoDrop 上测定样品浓度。

40. 为了长期保存，加入无菌叠氮化钠至 1 mM 终浓度。

现在你可以在你的实验中使用它们了，比如（已经拖延一周的）Western blot实验。

图 4：Western blot实验

参考文献与相关资料

https://www.addgene.org/

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更新日期：2026-05-28

编制人：磊子

审稿人：叶凡