肺炎支原体多位点序列分型方案的建立

引言

肺炎支原体是人类主要的呼吸道病原体，可引起所有年龄段人群的上、下呼吸道疾病，并可能导致其他严重的肺外后遗症。

本研究基于8个管家基因（ppa, pgm, gyrB, gmk, glyA, atpA, arcC 和 adk）的序列， 开发了一种针对肺炎支原体的多位点序列分型（MLST）方案，并将其应用于55株肺炎支原体临床分离株以及M129和FH两株标准菌株。对受试的57株肺炎支原体分离株，共鉴定出12种序列类型（STs），每株分离株的分辨指数为0.21 STs。

该分型方案所用的MLST位点在10株菌株连续传代10次后显示出了稳定性。对8个位点连接序列进行的系统发育分析表明，存在两个与多位点可变数目串联重复分析（MLVA）类型直接相关的不同遗传簇。 通过基因组序列分析进一步证实了遗传MLST聚类，表明本研究开发的MLST方案具有基因组代表性。

此外，对于所检测的肺炎支原体分离株，该MLST方案比MLVA和P1分型法更具分辨力， 为深入详细分析观察到的肺炎支原体感染流行高峰提供了一种方法。

一、材料与方法

1、肺炎支原体菌株、培养条件及样本制备

本研究中分析的菌株包含55株肺炎支原体临床分离株以及FH（NCTC 10119, ATCC 15531）和M129（ATCC 29342）两株标准菌株。所有菌株均在支原体琼脂（Mycoplasma Experience, 英国萨里）上进行三次克隆纯化，并通过扩增p1基因确认其为肺炎支原体。

所有菌株随后均在支原体液体培养基（MLM）（购自英国萨里郡的 Mycoplasma Experience 公司）中进行培养。在进行基因组测序时，将菌株接种于 100 ml 肉汤培养基中生长，并使用 GenElute 细菌基因组 DNA 试剂盒（购自英国多塞特郡的 Sigma 公司）提取基因组 DNA。

针对细菌 DNA 的 PCR 扩增操作如下：取 500 μl 培养 4 天的菌液，经 17,000 × g 离心 10 分钟，弃去全部 MLM，用 50 μl 无菌水重悬沉淀后，通过煮沸裂解法（95℃ 处理 10 分钟）释放 DNA。

2、多位点序列分型（MLST）

分析所选用的管家基因，是在其他细菌物种中被认为具有保守性且受选择压力较低的基因（见表 1）。

这些位点的序列是参考肺炎支原体M. pneumoniae）FH 和 M129 菌株的可用基因组序列（FH 株 GenBank 登录号：NC_017504.1； M129 株 GenBank 登录号：NC_000912.1），以及 35 株临床分离株的现有全基因组序列筛选得出的。

初始分析共纳入了 10 个基因：RecA 蛋白recA）、无机磷酸酶ppa）、磷酸甘油酸变位酶pgm）、DNA 促旋酶 B 亚基gyrB）、鸟苷酸激酶gmk）、丝氨酸羟甲基转移酶glyA）、延伸因子 Pefp）、ATP 合酶 α 亚基atpA）、氨基甲酰激酶arcC）以及腺苷酸激酶adk）； 但在最终的 MLST 方案中排除了recA 和efp。用于 PCR 扩增的位点区域，是基于蛋白质编码序列（CDS）中含有核苷酸多态性的区段来确定的。

表1：MLST位点用于已建立的细菌MLST方案中，也存在于肺炎分枝杆菌中

利用表 2 中所列的引物进行 PCR，以扩增另外 20 株肺炎支原体M. pneumoniae）临床分离株中的靶基因。 每个位点序列的扩增反应均在 DNA 热循环仪（Techne Prime，购自英国斯通市 Techne 公司）中进行。

50 μl 的反应体系包含：1× GoTaq Flexi 缓冲液（Promega，购自英国南安普敦）、1.5 mM MgCl₂、0.2 mM 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、 每种引物各 0.5 pmol/μl、1.56 U GoTaq DNA 聚合酶（Promega），以及 2.5 μl 模板 DNA。

PCR 程序设置为：94℃ 预变性 3 分钟；随后进行 35 个循环（94℃ 变性 60 秒，60℃ 退火 60 秒，72℃ 延伸 60 秒）； 最后在 72℃ 下彻底延伸 10 分钟。引物序列及 PCR 产物大小详见表 3。PCR 产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分析，并使用溴化乙锭（EB）进行染色观察。所有 PCR 实验均进行了双重复操作。

表2：本研究中开发的引物对及不同位点的变异性

二、研究结果

对两个标准菌株 M129 和 FH 以及 35 株肺炎支原体M. pneumoniae）临床分离株的基因组序列中 10 个基因靶标进行初步检测，发现其中有 8 个基因存在单核苷酸多态性（SNP）形式的变异。由于recA 和efp 基因在所有分析的序列中均 100% 保守，因此被排除在 MLST 方案之外。

通过基因组序列分析，以及对另外 20 株临床分离株的全部 8 个靶标进行额外的 PCR 扩增和测序，最终共解析出 12 个序列类型（STs）。针对肺炎支原体的分型鉴别能力为每株分离株对应 0.21 个 ST。

每个独立位点观察到的 SNP 数量及多态性位点的百分比详见表 2。其中pgm 基因的 SNP 数量最多（10 个），且在校正了序列长度后，其多态性位点的百分比也最高（0.93%）。每个位点的等位基因数量从 2 个ppagyrBgmk 和arcC）到 4 个atpA）不等（见表 3）。

Hunter-Gaston 多样性指数（DI）检验（该指数范围从无多样性的 0.0 到完全多样性的 1.0） 表明，各 ST 之间呈现中等程度的多样性（DI = 0.784；95% 置信区间 [CI]：0.716 ~ 0.852）。其中pgm 表现出最高的个体多样性（DI = 0.620；95% CI：0.566 ~ 0.674），而arcC 的多样性最低（DI = 0.069；95% CI：0.000 ~ 0.158）。

在这 57 株分离株集合中，由这 8 个位点组成的 MLST 方案的分辨力（Hunter-Gaston DI）为 0.784。相比之下，针对这 57 株分离株，P1 分型法的 Hunter-Gaston DI 为 0.567，MLVA 方案的 DI 为 0.633；因此，本 MLST 方案对受试分离株具有更高的分辨力。

此外，已有研究表明成熟的 MLVA 方法比 P1 分型法具有更高的分辨力， 这一点在本研究中得到了证实。各个 MLST 位点的等位基因多样性存在显著差异，其中pgmglyAatpAgyrBgmk 和ppa 位点的分辨力高于adk 和arcC 位点。由于这组标记物表现出不同程度的 Hunter-Gaston DI， 从理论上讲，这种 MLST 方法比其他现有方法更适合流行病学研究。

参考文献

1、Waites K, Talkington D. 2004. Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen. Clin Microbiol Rev 17:697–728. doi: 10.1128/CMR.17.4.697-728.2004.

2、Meyer Sauteur P, Jacobs B, Spuesens E, Jacobs E, Nadal D, Vink C, van Rossum AMC. 2014. Antibody responses to Mycoplasma pneumoniae: role in pathogenesis and diagnosis of encephalitis? PLoS Pathog 10:e1003983. doi: 10.1371/journal.ppat.1003983.

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更新日期：2026-05-28

编制人：大刘

审稿人：叶凡