新型不依赖 NAD 的副鸡禽杆菌的分离鉴定与分子特征研究

来源：武汉市灰藻生物科技有限公司　　浏览量：44　　发布时间：2026-05-19 13:23:48

一、引言

鸡传染性鼻炎（IC）是一种由副鸡禽杆菌Avibacterium paragallinarum，以前称为副鸡嗜血杆菌（Haemophilus paragallinarum）引起的鸡上呼吸道疾病。

IC 的发病率在世界许多地区呈上升趋势，影响所有年龄段的鸡，包括家禽养殖场的本地鸡（土鸡）和蛋鸡。此外，该病影响育成鸡和产蛋鸡，具有重大的经济意义，因为它增加了淘汰率并导致产蛋量下降。在疾病的急性期，其特征是面部肿胀、窦和结膜发炎以及鼻腔流出脓性分泌物。

早在 1920 年，Beach 等人就认为 IC 是一种独立的临床实体。由于该病在混合感染中经常被误诊，特别是与鸡痘混淆，因此多年来其常见的病原体一直未知。 DeBlieck（1932）将致病菌命名为鸡嗜血杆菌鼻炎杆菌Bacillus hemoglobinophilus coryzae gallinarum）。Elliot 和 Lewis 以及 Delaplane 等人在 1934 年提出了双名法Haemophilus gallinarum。

由于其生长需要 x 因子（血红素）和 v 因子（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD），在 20 世纪 30 年代进行的研究中，IC 的致病原被鉴定为H. gallinarum。使用疫苗有助于预防和控制传染性鼻炎等传染病。尽管进行了免疫接种，但仍存在感染疾病的风险。可以根据症状、尸体剖检结果和病原体的细菌学测试来识别和分离病原体，从而做出诊断。

大多数副鸡禽杆菌分离株需要 NAD 作为生长因子。但也已鉴定出不依赖 NAD 的分离株以及具有不寻常生长特性的分离株。不能发酵 D-木糖和海藻糖以及缺乏过氧化氢酶，将副鸡禽杆菌与其他禽杆菌属物种区分开来。诊断基于临床症状，通过生化测试进行确认。使用聚合酶链式反应（PCR）进行快速、准确和精确的诊断是避免鼻炎造成损害的基础。

近年来，该病的患病率从 14% 增加到 25%，促使全球采取预防措施。根据加州动物健康与食品安全实验室系统（California Animal Health and Food Safety Laboratory System）的数据，2017 年加州的鼻炎病例显著增加，应始终根据这些发现建立并更新适当的群体免疫和生物安全标准。然而，关于该病在伊朗的流行情况没有具体信息。

Razi 研究所在 2020 年提供了有关疾病诊断的最新信息。同时，疑似 IC 的临床症状在商业家禽中很常见，并且在未完成药敏试验（antibiogram）的情况下进行各种药物治疗，并且广泛使用进口的 IC 疫苗。然而，在伊朗，关于 IC 及其病原体的研究很少，仅有少数关于 IC 病原体分离和鉴定的报告。

本研究旨在分离、分子鉴定副鸡禽杆菌细菌，并调查其生化特性及对抗生素的敏感性。

二、材料与方法

1、样本采集和细菌分离与培养

分离株来自商业肉种鸡和蛋鸡养殖场，这些养殖场疑似发生 IC 暴发。采集了 20 份疑似感染 IC 的散养鸡的咽拭子，并转移至添加了 0.0025 mg/mL NAD 的 BHI 肉汤培养基中。

采集的样本在实验室中培养时间少于 2 小时，以避免细菌失活。样本在含有表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）ATCC 14990 辅助菌培养物的巧克力琼脂平板上，于 37°C、5% CO2 条件下培养 24 至 48 小时，无论其是否依赖 NAD。依赖 NAD 的副鸡禽杆菌会出现在辅助菌培养物旁边或紧邻处（卫星现象）。

具有上述典型副鸡禽杆菌形态的、呈现卫星生长（依赖 NAD，来自巧克力琼脂）和非卫星生长（不依赖 NAD，在巧克力琼脂上生长，如果存在的话）的菌落，均进行了生化鉴定测试。

2、生化鉴定

为了进行初步鉴定，对呈现卫星生长的菌落进行革兰氏染色，并使用革兰氏染色技术评估其过氧化氢酶、氧化酶、脲酶和碳水化合物发酵情况。副鸡禽杆菌不能发酵 D-木糖和海藻糖且缺乏过氧化氢酶，这使其与其他禽杆菌属物种区分开来。

3、分子鉴定

(A) 引物设计：使用针对副鸡禽杆菌属设计的 16S rRNA 特异性引物，通过 PCR 测定对分离的细菌进行鉴定和验证。获取并利用了 GenBank 数据库（美国国家生物技术信息中心；http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中副鸡禽杆菌物种 16S 核糖体 RNA 基因的已批准序列（AY498868.1）。

使用 Primer Express 生物信息学软件（www.fishersci.se）设计了该研究的引物（表 1）。使用 BLASTn 在线工具（GenBank, NCBI, USA）和核糖体数据库项目（RDP II, USA）的 Sequence Match 程序对选定的引物进行了验证。然后由公司合成引物。

(B) DNA 提取和 PCR 反应：通过煮沸法裂解细菌细胞提取 DNA。将细菌沉淀悬浮在 200 μL TE 缓冲液（Tris-HCl [10 mM]：EDTA [1 mM]）中 15 分钟，然后煮沸。煮沸后，将无菌离心管立即浸入冰浴中 15 分钟，然后在室温下以 14,000 rpm 离心 5 分钟。将含有 DNA 的上清液（100 μL）转移至单独的无菌管中，并保存在 -20°C。

然后使用 Yekta Tajhiz Azma PCR 试剂盒进行 PCR 扩增，反应条件如下：95°C 变性 5 分钟，随后进行 30 个循环（95°C 1 分钟，60°C 1 分钟，72°C 1 分钟），最后在 72°C 延伸 5 分钟。

使用副鸡禽杆菌 ATCC 29545 作为阳性对照。使用无 DNA 的离心管作为阴性对照。使用 Nanodrop 设备（NanoDrop ND-2000 分光光度计，NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA）对提取的 DNA 进行定量和质量测定。

在此方法中，通过读取 A260/A280 比值来确定 DNA 的定性特性，其中测量 DNA 在 260 nm 波长下的光吸收量以确定 DNA 含量。OD260/OD280 的最佳情况约为 1.8-2，小于 1.8 的值表示存在蛋白质污染和其他紫外吸收物。大于 2 的比值表示样品中 RNA 含量较高。

表1：引物

4、抗生素敏感性试验

抗生素敏感性试验采用 Chukiatsiri 等人（2012）的方法并进行轻微改良。针对副鸡禽杆菌分离株，筛选了目前最常用的抗生素纸片。在进行测试前，将细菌悬液的浊度调整至 0.5 麦氏比浊标准，随后使用无菌棉签将其均匀涂布于 Mueller-Hinton 琼脂培养基上。

本次测试的抗生素包括：庆大霉素（10 μg）、大观霉素（100 μg）、亚胺培南（10 μg）、四环素（10 μg）、哌拉西林-他唑巴坦（100 + 10 μg）以及头孢他啶（30 μg）。

培养基置于含 5% CO₂ 的培养箱中，在 37°C 条件下培养。培养 24 小时后观察抑菌圈，测定并记录抑菌圈直径（单位为毫米）。根据临床和实验室标准化协会（CLSI）M61 文件的标准，对药敏结果进行分类判定（敏感、中介或耐药）。

5、统计分析

根据卡方检验和 Fisher 精确检验的结果，基于调查开展年份和动物日龄的血清学调查结果之间存在显著差异。为了比较各组的均值，采用了单因素方差分析（One-way ANOVA），并在进行多重比较以评估实验组临床症状评分时，应用了 Bonferroni 校正法。在所有统计分析中，P < 0.05 被视为具有统计学显著性。

三、结果

1、病例

如表2所示，为了分离副鸡禽杆菌A. paragallinarum），研究人员对有产蛋量下降病史的家禽养殖场中的禽类进行了眶下窦拭子采样。

参与鸡传染性鼻炎临床暴发的副鸡禽杆菌分离株的尸体剖检（PME）详细描述

表2：参与鸡传染性鼻炎临床暴发的副鸡禽杆菌分离株的尸体剖检（PME）详细描述

感染不同副母伞菌分离株的鸡的体征比例

图1：感染不同副母伞菌分离株的鸡的体征比例。（a）面部水肿或肿胀。（b）观察到鼻涕

2、细菌分离与生化鉴定

本部分提供了关于固体培养基（巧克力琼脂平板）上细菌及其菌落形态的信息（见图2）。在巧克力琼脂上出现透明、露珠状的菌落，表明存在副鸡禽杆菌的野毒株。

将疑似副鸡禽杆菌的菌株与表皮葡萄球菌（S. epidermidis）ATCC 14990 进行共培养时，在葡萄球菌划线附近也观察到了较大的菌落。这表明葡萄球菌引起了溶血作用并从红细胞中释放出 V 因子，从而促进了副鸡禽杆菌的生长增强，这也是对副鸡禽杆菌分离结果的初步确认。

副鸡禽杆菌在含 5% CO₂、37°C 条件下于血红素琼脂（巧克力琼脂）上培养 48 小时

图2：副鸡禽杆菌在含 5% CO₂、37°C 条件下于血红素琼脂（巧克力琼脂）上培养 48 小时。由于该细菌在普通血琼脂上生长不佳，通常将其接种于血红素琼脂上以便观察菌落。 (a) 副鸡禽杆菌在巧克力琼脂上的生长情况。(b) 巧克力琼脂上副鸡禽杆菌呈现透明的露珠状菌落。(c) 副鸡禽杆菌与表皮葡萄球菌 ATCC 14990 共同培养。 (d) 副鸡禽杆菌菌体增大，沿表皮葡萄球菌 ATCC 14990 的划线处形成较大的菌落；这是因为表皮葡萄球菌引起溶血，促使红细胞释放 V 因子，从而促进了副鸡禽杆菌的生长。

2020 年至 2021 年间，研究人员分离获得了 7 株野毒株，并通过革兰氏染色及生化试验将其鉴定为副鸡禽杆菌（A. paragallinarum）（见表 3）。所有分离株均为革兰氏阴性、过氧化氢酶缺失，且无法在麦康凯琼脂上生长。所有菌株均能发酵 D-甘露醇和麦芽糖产酸，但不能发酵 D-木糖或海藻糖（见表 3）。

表3：7 株野毒株检测结果

观察到麦芽糖和 D-木糖的产酸情况存在差异，据此根据碳水化合物发酵模式鉴定出了三种生化特性独特的生物变种。然而，在 5 号菌株中发现了麦芽糖碳水化合物发酵模式的差异。大多数分离株（7 株中的 4 株）生长需要 NAD 和 5% CO₂，但其中有 3 株（1 号、5 号和 7 号）不依赖 NAD，能够在厌氧条件下的血琼脂上生长。

3、副鸡禽杆菌的分子鉴定

本研究使用 Primer Express 生物信息学软件设计了引物。表2中的正向和反向引物被确定为副鸡禽杆菌(A. paragallinarum）的特异性引物。

首先使用 BLASTn 工具对设计的引物进行评估，基于100株不同的副鸡禽杆菌分离株的比对结果（查询覆盖度 Query Cover 为100%，一致性得分 Percent Identity 为100%），证实了针对副鸡禽杆菌属设计的引物序列具有高度特异性。

在种特异性PCR产物的电泳中观察到预期的165 bp条带，验证了对这些分离株的分子检测和鉴定（见图3）。根据PCR和生化试验的结果，鉴定出7株不同的副鸡禽杆菌菌株，并将其用于抗生素敏感性试验。

通过PCR对样本中的副鸡禽杆菌进行分子鉴定

图3：通过PCR对样本中的副鸡禽杆菌进行分子鉴定。M：100 bp Plus DNA Marker（YTA，伊朗）；C-：阴性对照；C+：阳性对照，副鸡禽杆菌 ATCC 29545（165 bp）；泳道 1、2、3、4、5、6 和 7：呈现 165 bp 条带的阳性样本。

4、抗生素敏感性

采用药敏试验（antibiogram）评估抗生素敏感性。根据表4的抗生素敏感性结果，所有7株副鸡禽杆菌菌株均对庆大霉素和大观霉素敏感（100%）。测试结果显示，1号、5号和7号菌株对超过三类抗生素产生耐药性，因此这些细菌属于多重耐药（MDR）细菌。受试菌株的抗生素耐药模式记录在表4中。

采用纸片扩散法对七株副鸡禽杆菌野毒分离株进行抗生素敏感性试验的总结

表4：采用纸片扩散法对七株副鸡禽杆菌野毒分离株进行抗生素敏感性试验的总结

四、结论

通过生化试验和PCR分析，从四个具有典型传染性鼻炎临床症状的养鸡场样本中分离出7株副鸡禽杆菌。大多数分离株（4/7）表现出典型的生长特性，即需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）及富集CO₂环境才能生长。

值得注意的是，其中有3株副鸡禽杆菌被发现在厌氧条件下无需NAD即可生长，属于新型不依赖NAD的菌株。根据碳水化合物发酵模式鉴定出一种生化生物变种，但在5号菌株中检测到麦芽糖碳水化合物发酵模式发生改变。

所有分离株均对庆大霉素和大观霉素敏感。然而，3株新型不依赖NAD的菌株（1号、5号和7号）被发现具有多重耐药性（MDR），对至少三类抗生素产生耐药。与常规依赖NAD的细菌相比，这3株不依赖NAD的分离株表现出更强的抗生素耐药性。不依赖NAD的副鸡禽杆菌的发现表明，该菌种的分布范围比以往认知的更为广泛。在传染性鼻炎的诊断及潜在防控工作中，应采取明确且谨慎的策略。

参考文献

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