分子实验笔记20:AAV载体的ddPCR滴度测定(ddPCR Titration of AAV Vectors)
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：51 发布时间：2026-04-28 17:19:36
一、 引言
本方案描述了如何使用微滴数字PCR（ddPCR, droplet digital PCR）对纯化的重组腺相关病毒载体（AAV）进行滴度测定。本方案特别使用了针对病毒载体中ITR（反向末端重复序列）元件的引物和探针，但也可针对其他靶点进行修改。本方案中概述的稀释系列基于AAV滴度范围为5E+12–5E+13 GC/mL，其中GC代表基因组拷贝数（genome copies），通常表示病毒颗粒的物理数量。用户可能需要根据其特定样品运行更低或更高的稀释度。
二、 开始前的准备
为降低试剂污染风险，我们建议在使用前将主混合液（master mixes）、引物和探针分装成小份。
使用前在冰上解冻主混合液、引物和探针。
用10%漂白剂擦拭所有移液器和工作台面。
三、 安全警告
AAV通常被视为生物安全一级（BSL-1），但根据插入片段的不同，可能需要二级（BSL-2）操作。请确保操作符合所在机构的生物安全规定。
图 1：生物安全
四、 设备
o II级A2型生物安全柜，Labconco 302411100 (Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet)
o 微滴数字PCR系统，Bio-Rad, DX200 (Droplet Digital PCR System)
o 热循环仪，Bio-Rad, T100 (Thermal Cycler)
o PCR板封膜仪，Bio-Rad, PX1 (PCR Plate Sealer)
o 1–10 µL 单道移液器
o 20–200 µL 单道移液器
o 200–1000 µL 单道移液器
o 1–10 µL 多道移液器
o 2–50 µL 多道移液器
o 20–200 µL 多道移液器
o 涡旋振荡器，VWR, 10153-688 (Vortex)
o 迷你离心机，Thermo Scientific, 10199-452 (Mini Centrifuge)
o 冰桶 (Ice bucket)
o 96孔冷冻盒（x 3）(96-well freezer blocks)
五、 试剂
o 分子生物学级水，Hyclone, SH30538.02 (Molecular Biology Grade Water)
o GeneAmp 10X PCR缓冲液，Appped Biosystems, N8080129 (GeneAmp 10X PCR Buffer)
o ddPCR探针Supermix（不含dUTP），Bio-Rad, 1863023 (ddPCR Supermix for Probes no dUTP)
o 10% Poloxamer 188，Thermo Fisher, 24040032
o 微滴生成油，Bio-Rad, 1863005 (Droplet generation oil)
o DG8微滴生成卡盒，Bio-Rad, 1864008 (DG8 cartridge)
o DG8垫圈，Bio-Rad, 1863009 (DG8 gasket)
o DG8卡盒架，Bio-Rad, 1863051 (DG8 cartridge holder)
o 8联排PCR管，Axygen, PCR-02-FCP-C (8-strip PCR tubes)
o ddPCR 96孔PCR板，Bio-Rad, 12001925 (ddPCR 96-well PCR plates)
o 48孔稀释板，Bio-Rad, MLL4801 (48-well dilution plate)
o 可穿刺铝箔热封膜，Bio-Rad, 1814040 (Pierceable Foil Heat Seal)
o Microseal粘性封板膜，Bio-Rad, MSB1001 (Microseal adhesive seal)
o 聚苯乙烯储液槽，VWR, 89094-662 (Polystyrene Reservoirs)
o 微量离心管，VWR, 87003-294 (Microcentrifuge tubes)
o 针对ITR的引物/探针 (Primers/probe targeting ITR):
ITR正向引物 (ITR Forward Primer): 5’-CGGCCTCAGTGAGCGA
ITR反向引物 (ITR Reverse Primer): 5’-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
ITR探针 (ITR Probe): -FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BBQ-
六、 试剂配制
o 含0.05% Poloxamer 188的1X PCR缓冲液:
使用前立即配制，并在使用前涡旋混匀。
500 µL GeneAmp 10X Buffer
25 µL 10% Poloxamer 188
4475 µL 分子生物学级水
七、 实验步骤
7.1 准备工作
1. 在处理任何病毒之前，准备好所有材料。
2. 确保引物、探针、10X PCR缓冲液和主混合液均已解冻。
3. 将引物、探针和主混合液涡旋15秒，然后在迷你离心机中离心10秒，并置于冰上。
4. 用漂白剂擦拭DG8卡盒架，并将其放入生物安全柜（BSC）中。
5. 确保用于稀释的BSC和用于微滴生成的BSC都配备了足够的移液器吸头和试剂储液槽。
专业提示: 在与主混合液配制和微滴生成（微滴生成BSC）不同的生物安全柜（稀释BSC）中进行病毒稀释，以确保PCR试剂和无模板对照（NTC）不被病毒污染。
6. 通过轻轻触摸屏幕预热96孔板封膜仪。
7.2 制备系列稀释液
1. 将一个48孔稀释板放入预冷的96孔冷冻盒中，并置于稀释BSC内。
2. 配制1X稀释缓冲液（见上方配方）。
3. 在微量离心管中保存约25 µL的1X稀释缓冲液，用作无模板对照（NTC）。
4. 将1X稀释缓冲液倒入聚苯乙烯试剂储液槽中。
5. 使用20–200 µL多道移液器，根据第13步列出的稀释方案，小心地将稀释缓冲液加入稀释板中。
6. 使用单道1–10 µL移液器，向48孔稀释板的稀释1中加入5 µL每种病毒样品，并吹打5–10次以混匀。
7. 按如下方法稀释病毒：充分混匀稀释液，但移液时要缓慢，以避免产生气溶胶。每次操作务必更换吸头。
o 稀释1 (20X): 5 µL 加入 95 µL 1X PCR缓冲液 (1:20)
o 稀释2 (20X): 5 µL 加入 95 µL 1X PCR缓冲液 (1:400)
o 稀释3 (20X): 5 µL 加入 95 µL 1X PCR缓冲液 (1:8,000)
o 稀释4 (20X): 5 µL 加入 95 µL 1X PCR缓冲液 (1:160,000)
o 稀释5 (20X): 5 µL 加入 95 µL 1X PCR缓冲液 (1:3,200,000)
o 稀释6 (2X): 50 µL 加入 50 µL 1X PCR缓冲液 (1:6,400,000)
o 稀释7 (2X): 50 µL 加入 50 µL 1X PCR缓冲液 (1:12,800,000)
o 稀释8 (2X): 50 µL 加入 50 µL 1X PCR缓冲液 (1:25,600,000)
8. 使用多道移液器进行系列稀释。
o 对于稀释1–5，使用设定为5 µL的1–10 µL多道移液器。
o 对于稀释6–8，使用设定为50 µL的20–200 µL多道移液器。
o 在稀释之间混匀时，使用设定为90 µL的20–200 µL多道移液器，上下吹打液体10–20次。
9. 用Microseal粘性封板膜轻轻覆盖整个稀释板——不要按压薄膜，只需轻轻覆盖，以防异物落入板中。
10. 将稀释板留在BSC内的预冷96孔冷冻盒上，直至使用。
7.3 配制主混合液
1. 将一个ddPCR板放在预冷的96孔冷冻盒上，并在微滴生成BSC中放置备用以冷却。
2. 在微量离心管中配制如下所示的ITR主混合液。对于8个样品，需配制足够9个样品使用的量。
| ITR主混合液 (ITR Master Mix) | 单个反应体积 | 9倍体积 | 终浓度 (Final Concentration) |
|---|---|---|---|
| 2X ddPCR探针Supermix（不含dUTP） | 10 µL | 90 µL | 1X |
| 10 µM ITR探针（FAM） | 0.5 µL | 4.5 µL | 250 nM |
| ITR正向引物（10 µM） | 1.8 µL | 16.2 µL | 900 nM |
| ITR反向引物（10 µM） | 1.8 µL | 16.2 µL | 900 nM |
| 无核酸酶水 (Nuclease-free water) | 5.9 µL | 71.55 µL | |
| 总体积 (Total Volume) | 20 µL |
3. 使用前将主混合液涡旋15秒，并在迷你离心机中离心10秒。
4. 将一个8联排PCR管放入预冷的96孔冷冻盒中。
5. 向每个PCR管中加入20 µL主混合液。注意将液体加至管底，避免液体沿管壁残留。
6. 轻轻盖上管盖——不要完全压紧，只需确保样品被覆盖即可。
7. 将PCR管带至用于稀释的BSC。
8. 在不扰动管内液体的情况下，轻轻打开PCR管盖。
9. 向相应的PCR管中加入5 µL稀释液6–8。吹打5次以混匀。
10. 轻轻盖上PCR管盖。
7.4 生成微滴
1. 将PCR管带至微滴生成BSC。
2. 在不扰动管内液体的情况下，轻轻打开管盖。
3. 向NTC管中加入第9步中预先分装的5 µL 1X稀释缓冲液。
4. 将一个DG8卡盒放入卡盒架中。
5. 使用2–50 µL多道移液器，将20 µL反应混合液加入卡盒的中间孔中。
6. 向聚苯乙烯试剂储液槽中加入800 µL微滴生成油。
7. 使用20–200 µL多道移液器，将70 µL微滴生成油加入底部孔排中。
8. 用DG8垫圈盖住卡盒，确保其固定牢靠。
9. 将卡盒架转移至微滴生成仪。关闭盖子并等待微滴生成完成。
10. 微滴生成后，使用20–200 µL多道移液器吸取40 µL微滴。
专业提示: 为确保微滴不被破坏，将移液器吸头直接插入孔中心并倾斜至45°角。在缓慢轻柔地吸取微滴时默数20秒。
11. 将微滴转移至预冷的PCR板中。
专业提示: 为确保微滴不被破坏，将移液器吸头插入并轻轻触碰孔底。将吸头提起约1 mm，触碰孔壁并将吸头倾斜至45°角。在沿管壁缓慢轻柔地排出微滴时默数20秒。
12. 将可穿刺铝箔热封膜（红色线朝上）盖在PCR板上。如果板封膜仪未达到温度，请触摸其屏幕使其升温。达到温度后，将带有铝箔的PCR板放在金属支撑块上。将支撑块放入板封膜仪并按下“Seal”按钮。
13. 板密封完成后，进行热循环。
7.5 热循环 (Thermal Cycling)
1. 运行以下PCR程序。
| 循环步骤 (Cycling Step) | 温度 (°C) | 时间 (min) | 升降温速率 (°C/sec) | 循环数 (# Cycles) |
|---|---|---|---|---|
| 初始变性 (Denaturation) | 95 | 10 | 2 | 1 |
| 变性 (Denaturation) | 95 | 0.5 | 2 | 50 |
| 退火/延伸 (Annealing/Extension) | 60 | 1 | 2 | 50 |
| 信号稳定 (Signal Stabilization) | 98 | 10 | 2 | 1 |
| 保温 (Hold) | 4 | ∞ | 2 | 1 |
2. PCR完成后，将板转移至微滴读取仪（Droplet Reader）。
3. 打开QuantaSoft软件，设置新的板布局。指定样品名称、实验类型、Supermix类型（ddPCR Supermix for Probes）、靶标名称和靶标类型。
4. 板布局完成后，选择“Run”开始微滴读取。
5. 微滴读取完成后，将所有孔的数据导出为CSV文件，并使用以下公式计算每个样品的滴度：
图2：滴度计算公式
其中:
o T = 滴度 (Titer), GC/mL
o R = 反应体积 (Reaction volume) (20 µL)
o C = 拷贝数/µL (Copies/µL)
o D = 病毒稀释因子 (Dilution factor of virus)
o V = 反应混合液中的病毒体积 (Volume of virus in reaction mix) (4 µL)
八、 示例数据
o 分析数据时，阴性微滴（黑色）和阳性微滴（蓝色）之间应有明显区分。
o 无模板对照（NTC）应接近零（例如B08孔）。在Addgene，我们认为NTC > 10的运行结果无效。
o 为降低NTC值，我们建议在使用前用10%漂白剂擦拭所有移液器和设备，并在使用过程中将所有试剂和样品置于冰上或预冷的96孔冷冻盒中。
o 在本方案中，为每个AAV样品制备一个稀释系列，并检测最后三个稀释度。被检测的样品是2倍系列稀释的，因此ddPCR获得的浓度应在各稀释度间以2倍的因子递减。
o 在下例中，一个样品的2倍系列稀释液被加载到A04、A05和A06孔中。如图2和下表所示，阳性微滴的浓度以约2倍的因子递减。
o 为提高滴度的准确性，请取多次测量的平均值。
图3：ddPCR 样本数据
| 样品 (Sample) | 稀释度 (Dilution) | 浓度 (Concentration) | 滴度 (GC/mL) (Titer (GC/mL)) | 平均滴度 (GC/mL) (Average Titer (GC/mL)) |
|---|---|---|---|---|
| AAV Sample 1 | 6400000 | 965 | 3.09E+13 | 3.2E+13 |
| 12800000 | 474 | 3.03E+13 | ||
| 25600000 | 271 | 3.47E+13 | ||
| NTC | N/A | 2.5 | N/A | N/A |
表格：稀释与滴度测定示例 (Table: Example dilutions and titrations)
参考文献与相关资料
https://www.addgene.org/
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更新日期：2026-04-26
编制人：磊子
审稿人：叶凡