分子实验笔记19:通过碘克沙醇梯度超速离心纯化AAV(AAV Purification by lodixanol Gradient Ultracentrifugation)

一、 引言

本方案可用于纯化任何血清型的腺相关病毒（AAV）。

在医学上，碘克沙醇（iodixanol）可用作静脉注射的等渗造影剂。在科研领域，碘克沙醇被用作一种等渗密度梯度介质，适用于病毒纯化以及细胞、细胞器、脂蛋白和大分子的分离。重要的是，碘克沙醇对哺乳动物细胞呈惰性且无毒。因此，据报道，与其它密度梯度介质不同，在使用纯化的病毒前无需去除碘克沙醇。尽管如此，我们仍建议在体内（in vivo）使用纯化的AAV之前进行缓冲液置换（buffer exchange）。

本方案中的碘克沙醇梯度由多个梯度层组成，用于从不纯的AAV制备物中分离杂质。15%的碘克沙醇层含有1M NaCl，可破坏大分子间的离子相互作用。40%和25%的梯度层用于去除密度较低的杂质，包括空衣壳（empty capsids）。60%的梯度层作为含基因组病毒颗粒（genome-containing virions）的垫层（cushion）。在梯度中加入酚红（phenol red）以便清晰区分各梯度层。该方法有助于富集含完整基因组的病毒颗粒。平均而言，经碘克沙醇纯化的AAV制备物中约含有20%的空颗粒。

图1：通过碘克沙醇梯度超速离心纯化AAV

二、 工作流程时间线

o 第1天: 纯化 (Purify)

o 第2天:缓冲液置换和浓缩 (Buffer exchange and concentration)

注意:这两个步骤也可以在一天内（较长的一天）完成。

三、 设备

o 超速离心机 (Ultracentrifuge)

o T70i转子或同等型号 (T70i rotor or equivalent)

四、 试剂

o Opti-Prep（60% 碘克沙醇）(Opti-Prep (60% Iodixanol))

o QuickSeal管 (QuickSeal tubes)

o QuickSeal管间隔垫 (QuickSeal tube spacers)

o 16号针头 (16 ga needle)

o 18号针头 (18 ga needle)

o 10 mL注射器 (10 mL syringe)

o 18号钝头针头，Hamilton (18 ga blunt edge needles, Hamilton)

o 1X PBS（pH 7.4）

o 1X PBS-MK缓冲液 (1X PBS-MK buffer)

o 100X Poloxamer 188

o NaCl

o MgCl₂

o KCl

o 离心过滤浓缩管（截留分子量100 kDa）(Centrifugal filter units (MWCO 100 kDa))

五、 试剂配制

1. 1 M NaCl/PBS-MK缓冲液:将5.84 g NaCl、26.3 mg MgCl₂和14.91 mg KCl溶解于1× PBS中，定容至100 mL。通过0.22 μm滤膜过滤除菌，4°C保存。

2. 1X PBS-MK缓冲液:将26.3 mg MgCl₂和14.91 mg KCl溶解于1× PBS中，定容至100 mL。通过0.22 μm滤膜过滤除菌，4°C保存。

3. PBS中的0.1% Poloxamer 188（A）:向49.5 mL PBS中加入500 µL 10% Poloxamer 188。

4. PBS中的0.01% Poloxamer 188（B）:向45 mL PBS中加入5 mL缓冲液A。

5. PBS + 200 mM NaCl中的0.001% Poloxamer 188（C）（制剂缓冲液）:向43 mL PBS中加入5 mL缓冲液B和2 mL 5 M NaCl。

六、 实验步骤

1. 碘克沙醇梯度的制备与上样:

o 15% 碘克沙醇层: 混合4.5 mL 60%碘克沙醇和13.5 mL 1 M NaCl/PBS-MK缓冲液。

o 25% 碘克沙醇层: 混合5 mL 60%碘克沙醇、7 mL 1X PBS-MK缓冲液和30 μL酚红。

o 40% 碘克沙醇层: 混合6.7 mL 60%碘克沙醇和3.3 mL 1X PBS-MK缓冲液。

o 60% 碘克沙醇层: 混合10 mL 60%碘克沙醇和45 μL酚红。

2. 使用10 mL注射器和18号钝头Hamilton针头，按以下顺序将各溶液小心地铺入QuickSeal管底部，注意避免产生气泡（图2）。

o 8 mL 15% 碘克沙醇层

o 5 mL 25% 碘克沙醇层

o 5 mL 40% 碘克沙醇层

o 3 mL 60% 碘克沙醇层

3. 小心地将最多5 mL的澄清上清液加到梯度顶部。使用1X PBS（或制剂缓冲液）将管加满。

4. 密封QuickSeal管。

5. 在T70i转子中，10°C下以350,000 x g离心90分钟。

专业提示 (Pro-Tip): 如果需要更多时间，也可以选择在18°C下以200,000 x g离心2小时。

6. 小心地将QuickSeal管从转子中取出，并放置在稳定的架子上。切勿扰动梯度！

7. 收集组分

7.1 选项1

o 在架子上准备一排约20个打开的1.5 mL微量离心管。这些管将用于收集梯度中的组分。一旦您清楚病毒从梯度中洗脱的位置，就可以减少收集的组分数。

o 在生物安全柜中，用18号针头小心地在QuickSeal管60%和40%梯度的界面处穿刺（见图3）。

o 将第一个微量离心管置于针头开口下方以收集组分。

o 用16号针头穿刺QuickSeal管顶部，并开始以每管0.5 mL至1 mL的体积收集组分。

o 避开40–25%界面附近的蛋白质物质。

专业提示: 一旦管顶被穿刺，含AAV的碘克沙醇溶液就会从位于40–60%界面处的针头流出。请确保微量离心管已妥善放置以收集溶液，否则会损失大量病毒。收集完第一份组分后，将架子移至下一个空管以收集下一份。流速起初会很快，然后逐渐减慢。

7.2 选项2

o 用18号针头从底部穿刺QuickSeal管。

o 立即开始以每管0.5至1 mL的体积在微量离心管中收集组分。

o 对每个QuickSeal管重复此操作。

o 收集的前3 mL对应于60%相，可弃去。

o 从40%相获得的组分含有纯化的AAV。

选项3

o 将连接10 mL注射器的18号针头在略低于60–40%界面处穿刺QuickSeal管。

o 针头斜面应朝上，面向40%梯度层。

o 每管最多收集5 mL，注意避免收集40–25%界面处的蛋白质物质。

o 对每个QuickSeal管重复此操作。

8. （可选）对于首次使用者，建议通过银染（silver stain）或SYPRO Ruby染色检测每个组分以确定纯度。仅保留最纯净的组分并合并用于透析（dialysis）。

9. 合并纯净的组分。

10. 浓缩与缓冲液置换 (Concentration and buffer exchange):

10.1 Poloxamer 188储备液

o Poloxamer 188, 10% 溶液

o A: PBS中的0.1%: 49.5 mL PBS + 500 µl Poloxamer 188

o B: PBS中的0.01%: 45 mL PBS + 5 ml A

o C: PBS中的0.001%: 45 mL PBS + 5 ml B + 200 mM NaCl

10.2 步骤

o 1 用15 mL 0.1% Poloxamer 188 PBS覆盖滤膜，并在室温（RT）下孵育10分钟。

o 2 4°C下3000 rpm离心5分钟，弃去滤过液（flow through）。

o 3 加入15 mL 0.01% Poloxamer 188 PBS，并在室温下孵育10分钟。

o 4 4°C下3000 rpm离心5分钟，弃去滤过液。

o 5 加入15 mL 0.001% Poloxamer 188 + 200mM NaCl PBS。

o 6 4°C下3000 rpm离心5分钟，弃去滤过液。

o 7 加入您的样品。

o 8 4°C下3500 rpm离心5–8分钟，弃去滤过液。

o 9 加入更多样品，4°C下3500 rpm离心2–5分钟，弃去滤过液。根据需要重复此步骤。

请注意: 碘克沙醇不易被去除。每次离心后，加入更多的制剂缓冲液和样品，并确保反复吹打几次，以混匀沉降在柱底部的碘克沙醇。

我们建议浓缩至至少500 µL。如果浓缩物体积小于500 µL，请用制剂缓冲液补足至该体积。

o 10 使用P1000移液器伸至滤器底部，反复吹打并冲洗滤器壁，以尽可能多地回收病毒。

11. 短期（2周）保存于4°C，或分装后长期保存于-80°C。

七、 示例数据

图2：超速离心前的碘克沙醇梯度。由于使用了酚红，各梯度层清晰可辨。

图3：左图：超速离心后的碘克沙醇梯度。箭头指示60–40%界面。垂直黑线指示纯化AAV的位置。右图：示意图，显示使用选项1收获纯化AAV时针头的位置。

图4：连续10个梯度组分的SDS-PAGE凝胶电泳银染结果示例。注意每个组分中污染物数量的增加。* AAV衣壳蛋白VP1, VP2, VP3；M 蛋白Marker。

参考文献与相关资料

https://www.addgene.org/

Zolotukhin, S., Byrne, B., Mason, E. et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther 6, 973–985 (1999). https://doi.org/10.1038/sj.gt.3300938

Grieger, J., Choi, V. & Samulski, R. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc 1, 1412–1428 (2006). https://doi.org/10.1038/nprot.2006.207

Strobel Benjamin, Miller Felix D., Rist Wolfgang, and Lamla Thorsten. Human Gene Therapy Methods. August 2015, 26(4): 147-157. doi:10.1089/hgtb.2015.051

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更新日期：2026-04-28

编制人：磊子

审稿人：叶凡