分子实验笔记18:在HEK293T细胞中生产AAV(AAV Production in HEK293T Cells)

一、 引言

本方案可用于从一个五层细胞培养板（Five Chambers Cell-Stack, CS5）（3,180 cm² - 相当于21个T-175培养瓶的表面积）生产腺相关病毒（AAV）。细胞培养板（Cell stacks）提供了一种高效的放大生产方式，无需处理大量T-175培养瓶。

二、 工作流程时间线

o 第0天: 在CS2中接种细胞 (Seed cells in CS2)

o 第2天: 在CS5中接种细胞 (Seed cells in CS5)

o 第3天 (上午): 转染细胞 (Transfect cells)

o 第7天 (上午): 收获细胞 (Harvest cells)

图1：细胞培养

三、 设备

o II级A2型生物安全柜 (Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet)

o 0.5–10 µL 单道移液器 (single channel pipette)

o 2–20 µL 单道移液器

o 20–200 µL 单道移液器

o 200–1000 µL 单道移液器

o 血球计数板或细胞计数仪 (Hemocytometer or cell counter)

o 冰桶 (Ice bucket)

o CO₂培养箱 (CO2 incubator)

o 移液控制器 (Pipet controller)

o 有害废物容器 (Hazardous waste container)

o pH计 (pH meter)

o 磁力搅拌器 (Stir plate)

o 磁力搅拌子 (Magnetic stir bar)

o 超声破碎仪 (Sonication)

o 耳罩 (Ear protection)

o 涡旋振荡器 (Vortex)

图2：细胞培养设备

四、 试剂

o 贴壁HEK293T细胞（理想情况下为AAV-293T克隆株）(Adherent HEK293T cells (ideally AAV-293T clones))

专业提示 (Pro-Tip):虽然这些细胞是贴壁的，但它们与培养皿表面的附着非常松散，操作时应格外小心。更换培养基时避免触碰细胞。

o T-175培养瓶，Corning 430825，175 cm² (T-175 flask)

o 五层细胞培养板（Cellstack 5），Corning 3319，3180 cm²

o 二层细胞培养板（Cellstack 2），Corning 3269，1272 cm²

o 热灭活胎牛血清（HI-FBS, Heat-inactivated FBS）

专业提示:不同品牌和批次的FBS可能会促进或抑制转染。请测试多种品牌和批次的FBS，以找到适合实验方案的产品。FBS可直接购买已热灭活的产品，也可在实验室中通过56°C加热30分钟进行灭活。

o 0.45 μm 聚醚砜（PES）滤器系统，Nalgene, 565-0010（或用于大体积的1000 mL 0.45 µm Rapid-Flow PES过滤装置，Nalgene 167-0045）

专业提示:请勿使用PES以外材质的滤器。AAV颗粒会粘附在许多其他材质表面，但不会粘附在PES上。使用PES滤器可最大化病毒滴度（titer）。

o 高糖DMEM，Corning 10-013-CV (DMEM high glucose)

o 低糖DMEM（1 g/L葡萄糖，含丙酮酸钠），Corning 10-014-CV（可选）(DMEM, low glucose)

o 7.5% 碳酸氢钠，Corning 25-035-CI（可选）(7.5% sodium bicarbonate)

o 1 M HEPES，HyClone SH30237.01（可选）

o L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（或替代的稳定型谷氨酰胺，如glutaGRO，Corning 25-015-CI）(L-alanyl-L-glutamine)

o Opti-MEM，Thermo Fisher 31985-070

o 0.05% 胰蛋白酶/EDTA（例如TrypLE，Thermo Fisher, 12605010）

o 不含钙镁离子的1X PBS（pH 7.4），Corning 21-040-CV（阳离子会影响贴壁细胞的附着）(1X PBS pH 7.4 without calcium or magnesium)

o 1 mg/mL 聚乙烯亚胺（PEI）25 kDa MW (1 mg/mL Polyethylenimine (PEI))

专业提示:本方案中可使用其他转染试剂，但必须对其条件进行优化。

o 转染质粒：pHelper；pRC（Rep-Cap），表达目的基因的质粒 (Plasmids for transfection)

o Triton X-100

o 全能核酸酶/Benzonase或DNAse I（Milppore 71205-3）(Benzonase/DNAse I)

o 40% 聚乙二醇8000（PEG 8000）+ 0.5 M NaCl

o 细胞裂解缓冲液（50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂）(Cell lysis buffer)

图3：细胞培养试剂

五、 试剂配制

1. 完全DMEM培养基 (DMEM Complete)

o 10% v/v FBS 和 4 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（或稳定替代物，如glutaGRO）:向500 mL高糖DMEM瓶中加入55 mL热灭活FBS和5 mL glutaGRO（或11 mL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）。4°C保存。

2. D1 + 0.1 M 山梨醇（可选）(D1 + 0.1 M sorbitol)

o 低糖DMEM + 1% v/v HI-FBS + 0.1 M 山梨醇:根据我们的经验，较低葡萄糖和较低FBS的培养基在收获过程中可减少滤器堵塞。添加山梨醇已被证明可将病毒滴度提高多达1.8倍。

o 配制方法：向750 mL含1 g/L葡萄糖的DMEM中加入57 mL 1.46 M山梨醇、7.5 mL HI-FBS、7.5 mL 100X glutaGRO、7.5 mL 7.5%碳酸氢钠和7.5 mL 1 M HEPES。

3. 1 mg/mL 聚乙烯亚胺（PEI）溶液:

o 将100 mg PEI粉末溶解于100 mL去离子水中。

o 在搅拌下，缓慢加入盐酸直至溶液变澄清。

o 检测溶液pH值，并用盐酸或氢氧化钠将pH调整至7.0。

专业提示:加入酸或碱后，此溶液的pH值会迅速漂移。每次只加几滴，充分混匀后再检测pH，以防过度调节。

o 让溶液混合10分钟，然后再次检查pH以确保其未发生漂移。

o 通过0.22 μm滤膜过滤溶液。

o 分装500–1000 μL至无菌管中。

o -80°C保存。

o 解冻后，溶液可在4°C保存长达2个月。超过2个月后，请丢弃该管并解冻新的工作液。

4. 40% 聚乙二醇（PEG）8000溶液:

o 将400 g PEG 8000和24 g NaCl溶解于去离子水中，并定容至1000 mL。

o 室温（RT）下搅拌至完全溶解。

专业提示:由于PEG粘度很高，此步骤颇具挑战性。在中等温度下搅拌可促进更快溶解。

o 将pH调整至~7.4。

o 高压灭菌或无菌过滤。

专业提示:建议在冷却期间持续搅拌，否则溶液可能会分相。

o 分装后4°C保存。

5. 细胞裂解缓冲液: 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂

o 向2 L无菌瓶中加入：1836 mL去离子水 + 100 mL 1 M Tris HCl (pH 8.5) + 60 mL 5 M氯化钠 + 4 mL 1 M氯化镁。

o 盖紧瓶盖，多次倒置混匀。

o 将pH调整至~8.5。

o 通过0.22 μm滤膜进行无菌过滤。

o 4°C保存。

六、 开始前的注意事项

HEK293T细胞的健康状态对获得最佳AAV产量至关重要。

o 切勿让细胞过度生长。在维持阶段每周传代两次，不要让细胞达到100%汇合度（80–90%为理想状态）。

o 在转染前一天进行传代和铺板。

o 传代超过30次后，请复苏一支新的细胞。

七、 实验步骤

1. 从2个T-175培养瓶中胰酶消化并重悬HEK293T细胞。细胞汇合度应约为80%。每个T-175培养瓶操作如下：

o 吸弃培养基，用10 mL PBS洗涤一次。

o 吸弃PBS，加入2 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA。等待约2分钟。

o 加入10 mL完全DMEM培养基以中和胰酶。

o 反复用力吹打多次，以获得单细胞悬液（无细胞团块）。

2. 将2个T-175培养瓶的细胞合并。用完全DMEM培养基将总体积调整至300 mL并混匀。

3. 将所有细胞接种到1个CS2中。放回培养箱培养48小时。

4. 从CS2中胰酶消化并重悬细胞。细胞汇合度应约为80%。

o 吸弃培养基，用60 mL PBS洗涤一次。

o 吸弃PBS，加入35 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA。

o 等待约2-3分钟，待细胞脱落。

o 轻轻敲击CS2侧面以帮助细胞脱落，加入200 mL完全DMEM培养基，然后将细胞转移至无菌瓶中。

o 用100 mL完全DMEM培养基冲洗CS2，并与上一步收获的细胞合并。

o 反复吹打或用力摇晃以获得单细胞悬液（无细胞团块）。

o 使用血球计数板或细胞计数仪进行细胞计数。

5. 将3.5亿个细胞从CS2接种到一个CS5中，总体积为850 mL。放回培养箱培养24–36小时。

6. 进行转染：

o 计算每种质粒所需的量，以在CS5中达到1:1:1的摩尔比，总DNA量为2 mg。

我们总共需要2 mg DNA，即2000 μg。

利用三种质粒的总碱基数，我们可以确定为达到1:1:1摩尔比所需的总μg/bp：

2000 μg / 24,961 bp = 0.08 μg/bp

因此，每种质粒所需量为：

RepCap: 0.08 μg/bp × 7,265 bp = 582.1 μg

所需体积: 582.1 μg / 1.0 μg/μL = 582.1 μL

pHelper: 0.08 μg/bp × 11,854 bp = 949.8 μg

所需体积: 949.8 μg / 1.0 μg/μL = 949.8 μL

转移质粒: 0.08 μg/bp × 5,842 bp = 468.1 μg

所需体积: 468.1 μg / 1.0 μg/μL = 468.1 μL

o 将100 mL OptiMEM分装到一个无菌的250 mL瓶中。

o 将774 mL DMEM + 2% HI-FBS分装到一个无菌的1 L瓶中。

o 将每种质粒DNA加入含Opti-MEM的瓶中。充分混匀。

o 加入4 mL PEI（DNA:PEI质量比为1:2）。上下剧烈摇晃瓶子30秒（产生气泡也没关系）。

o 室温（RT）孵育15分钟。注意，更长的孵育时间可能会降低转染效率。

o 将OptiMEM + DNA + PEI溶液加入含有774 mL DMEM + 2% HI-FBS的瓶中。充分混匀。

o 将CS5从培养箱中取出，将培养基倒入废液容器中。

o 小心地将OptiMEM + DNA + PEI溶液加入CS5中。确保所有五层都被培养基覆盖。293T细胞非常脆弱且极易脱落——添加培养基时应远离细胞（不要直接倒在细胞上），可通过小心地前后倾斜CS5来调整液面。

专业提示:为帮助培养基在五层间均匀分布，可将CS5倾斜，使培养基流向瓶盖。如果培养基接触到瓶盖，请在将CS5放回培养箱前更换新盖。

o 将CS5放回培养箱培养96小时。此孵育时间可根据血清型进行调整。通常AAV2在48–72小时收获，而其他血清型则在96–120小时收获。

（可选）在转染后约18小时进行培养基更换。更换培养基可以减少PEI相关的毒性，并允许添加其他成分，如山梨醇和碳酸氢钠。研究发现山梨醇可将病毒滴度提高多达1.8倍。参见上方D1 + 0.1 M山梨醇的配方。

小心地将培养基倒入废液容器中。轻轻地将新培养基倒入CS5中。确保培养基在各层间均匀分布。将CS5放回培养箱继续培养约72小时。

7. 通过轻敲CS5侧面来收获细胞和培养基。细胞应很容易脱落。

8. 将细胞和培养基转移至500 mL锥形离心管中。

9. 用100 mL PBS冲洗CS5一次，并入已收获的细胞和培养基中。

10. 4°C下，3900 rpm离心20分钟，沉淀细胞。

11. 将细胞沉淀置于冰上，并将上清液转移至无菌的500 mL瓶中。

12. 按以下步骤处理上清液：

o 通过0.45 μm PES滤膜过滤。

o 加入40% PEG，使最终PEG浓度为8%。

每100 mL上清液加入25 mL PEG溶液。如有需要，可分装至2个500 mL无菌瓶中。

o 加入磁力搅拌子，在4°C下缓慢搅拌1小时，然后在4°C静置3小时以使病毒充分沉淀。如有需要，沉淀步骤可在4°C过夜进行。

o 将全部样品转移至3个500 mL锥形离心管中，4°C下3900 rpm离心15分钟。

o 弃去上清液，用总计5 mL细胞裂解缓冲液（配方见上文）重悬沉淀。反复吹打以完全重悬每个沉淀。

o 合并重悬的沉淀，并置于冰上。

13. 按以下步骤处理上述的细胞沉淀：

o 加入总计12.5 mL细胞裂解缓冲液以重悬并裂解细胞。反复吹打以完全重悬每个沉淀。

o 合并所有重悬的细胞沉淀，进行超声破碎：50%振幅，5次×1秒脉冲，每次脉冲之间至少在冰上放置5分钟。每轮超声之间放回冰上，以避免样品过热。每轮超声之间充分混匀。

o 超声直至台盼蓝（Trypan Blue）染色后镜下看不到活细胞。

o 4°C下3900 rpm离心10分钟，沉淀细胞碎片。

o 将澄清的裂解液转移至上一步（第12步）的重悬病毒管中。

14. 每毫升病毒悬液加入50单位的全能核酸酶（Benzonase）（根据第12和13步，应有约18 mL悬液）。全能核酸酶是一种内切核酸酶，可降解包装过程中残留的任何DNA。

15. 37°C孵育45分钟。

16. 现在你可以进行纯化了。澄清的上清液可在4°C保存过夜，然后再进行纯化。

八、 示例数据

图4：不同汇合度的HEK293T细胞。本AAV生产方案应从汇合度约80%的细胞开始（中间图板）。这些细胞使用10倍物镜成像，并在拍摄前2天进行了传代。

参考文献与相关资料

https://www.addgene.org/

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更新日期：2026-04-26

编制人：磊子

审稿人：叶凡