分子实验笔记17：分子实验笔记:限制性内切酶消化法质粒克隆(亚克隆)

一、 引言

只要目标 DNA 片段两端已被限制性酶切位点（restriction sites）所界定，且这些位点在目的载体（target vector）上以相同方向存在，即可使用本方法轻松地将任意 DNA 片段从一个载体转移至另一个载体。

基于限制性内切酶消化的亚克隆（Subcloning by restriction digest）是分子生物学实验室中常用的技术。本教程将以如何将 cDNA 从一个质粒转移到另一个质粒为例进行说明。但该技术同样适用于在质粒之间转移启动子（promoters）、筛选标记（selectable markers）或任何其他 DNA 元件（DNA elements）。

假设正在启动一个关于感兴趣的基因（简称为 YGOI）的新项目。可能需要在培养的哺乳动物细胞（cultured mammalian cells）中表达 YGOI。然而，目前能找到的 YGOI 全长 cDNA 仅存在于一个细菌表达载体（bacterial expression vector）中。通过亚克隆（subcloning），可以轻松地将 YGOI 转移至哺乳动物表达载体（mammalian expression vector）中，从而开展后续研究。

图 1：亚克隆流程

二、 实验设计（酶的选择）

许多 DNA 分析工具（包括 Addgene 的Sequence Analyzer ）可帮助识别特定序列中存在的限制性酶切位点。在选择限制性内切酶（restriction enzymes）时，应优先考虑满足以下条件的酶：

o 位于插入片段（insert）两侧，但不会在插入片段内部切割；

o 位于受体载体（recipient plasmid）的理想位置（通常在多克隆位点 Multiple Cloning Site, MCS 内），且不会在质粒其他区域切割；

o 能确保插入片段在受体载体中以正确方向（correct orientation）插入（你肯定不希望表达基因的反义链 / antisense version！）；

o 若构建融合蛋白（fusion protein），需确保插入片段与受体载体中的标签（tags）或融合蛋白保持正确的读码框（in frame）。

理想情况下，应选择两种不同的限制性内切酶进行亚克隆。也可使用单一酶，但此时需对受体载体进行磷酸酶（phosphatase）处理，并在后续通过特异性酶切鉴定（test digest）验证插入片段的方向是否正确。

如果无法找到完全满足上述条件的酶，也无需担忧，还有其他策略可选：

o 在插入片段两端添加所需酶切位点：可通过基于 PCR 的克隆，在引物（opgos）末端引入所需的限制性酶切位点，从而获得两端带有与受体载体 MCS 兼容位点的插入片段。但请注意，仍需避免所选酶在插入片段内部有切割位点。

o 改造受体载体的 MCS：可通过退火寡核苷酸克隆对受体载体的多克隆位点进行修饰，引入所需酶切位点。

若幸运地拥有多种满足方向性和位置要求的酶组合，建议进一步确认其中某组酶是否可在同一种限制性内切酶缓冲液（restriction enzyme buffer）中高效工作。若能使用同一缓冲体系，将显著简化后续实验步骤并节省时间。

三、 实验流程

图 2：实验步骤

1. DNA 酶切

分别对供体质粒（donor plasmid）和受体质粒（recipient plasmid）进行限制性酶切反应。由于凝胶纯化步骤会造成 DNA 损失，建议使用足量起始材料：推荐供体质粒 1.5–2 μg，受体质粒 1 μg。此外，务必确保受体质粒被两种酶充分切割，因此酶切反应时间应至少持续 4 小时，过夜更佳。

若仅使用一种限制性内切酶，或所用酶产生兼容性粘端（compatible overhangs）甚至平末端（no overhangs），则需使用磷酸酶（phosphatase）处理受体质粒，以防止其自连环化（re-circularization）。根据所选磷酸酶类型（如 CIP / 小牛碱性磷酸酶 calf alkaline phosphatase 或 SAP / 虾碱性磷酸酶 shrimp alkaline phosphatase），可在凝胶纯化前或连接前进行处理，请严格遵循厂商说明书操作。

2. 凝胶纯化插入片段与载体骨架

将酶切产物进行琼脂糖凝胶（agarose gel）电泳，并通过凝胶回收纯化目标 DNA 条带。为获得清晰锐利的条带并便于切胶，建议：使用宽齿梳、较低电压慢速电泳、样本间跳过空泳道。除 DNA 分子量标准（DNA ladder）外，建议同时点样未酶切的原始质粒作为对照，以便在酶切结果异常时辅助排查问题。

使用偏好的凝胶纯化方法切下并回收插入片段和线性化受体载体骨架后，务必测定回收 DNA 的浓度。

3. 连接反应

进行 DNA 连接反应，将插入片段与受体载体骨架连接。

标准连接反应中，总 DNA 量建议约为 100 ng。理想情况下，受体载体与插入片段的摩尔比应为约 1:3。由于两者碱基数不同，仅凭浓度难以精确计算比例。一种实用策略是：对每个目标质粒设置两组连接反应，采用不同比例的载体与插入片段。

同时必须设置阴性对照：例如，仅连接受体载体（不加插入片段），用于评估未完全酶切或自连的载体背景水平。

4. 转化

将连接产物转化至感受态细菌中，请遵循所用感受态细胞的厂商说明。

对于常规克隆，可将 1–2 μL 连接产物转化至 DH5α 或 TOP10 等常用化学感受态细胞中。若连接产物中总 DNA 量极低（<1 ng）或难以获得菌落，建议使用高转化效率（higher competency）的感受态细胞。此外，若最终构建的质粒较大（>10 kb），建议使用电转化感受态细胞以提高效率。

转化后平板上的菌落数量是判断实验是否成功的初步指标：含插入片段的连接产物平板应显著多于仅含受体载体的对照平板（recipient plasmid alone）。后者反映的是“背景”水平——即在实验组平板中预期出现的非正确克隆数量。

若受体载体对照平板上菌落过多，可进一步测试：将受体载体单独进行连接反应，一组加连接酶，一组不加。若不加连接酶仍有大量菌落，说明存在未完全酶切的环状质粒；若仅加连接酶组菌落显著增多，则表明是载体自连所致。

若完全无菌落生长，应进行阳性对照（如转化已知完好质粒）以确认转化体系正常；同时检查抗生素是否正确，并尝试调整连接反应中载体与插入片段的比例。

5. 阳性克隆筛选与质粒验证

最后，需挑取单菌落并验证连接是否成功。根据对照平板的背景菌落数量，挑取 3–10 个菌落（背景越高，需挑取越多），接种过夜培养以提取质粒 DNA。

取 100–300 ng 纯化质粒，用克隆时所用的限制性内切酶进行诊断性酶切，并在琼脂糖凝胶上电泳分析。理想情况下应观察到两条带：一条为载体大小，另一条为插入片段大小。

若使用单一酶或产生兼容粘端的酶进行克隆，则无法通过此酶切区分方向，需额外设计诊断性酶切方案（如使用能产生不对称切割的酶组合）以验证插入片段方向。

恭喜你现已成功将 YGOI 构建至哺乳动物表达载体中，可以开始后续功能研究了。

参考文献与相关资料

https://www.addgene.org/

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更新日期：2026-04-28

编制人：磊子

审稿人：叶凡