分子实验笔记16：pLKO.1 - TRC 克隆载体（pLKO.1 - TRC Cloning Vector）

一、 引言

pLKO.1 克隆载体是 RNA 干扰联盟 (TRC) 构建针对 15,000 个人类基因和 15,000 个鼠类基因的 shRNA 文库所使用的骨架载体。

pLKO.1 是一个复制缺陷型慢病毒载体 (replication-incompetent lentiviral vector)，由 TRC 选定用于 shRNA 的表达。

pLKO.1 可通过直接转染 (direct transfection) 进入细胞，也可包装成慢病毒颗粒 (lentiviral particles) 以感染目标细胞系。

一旦导入细胞，pLKO.1 中编码的嘌呤霉素抗性标记 (puromycin resistance marker) 便于进行稳定的筛选 (stable selection)。

图 1：包含 shRNA 插入片段的 pLKO.1 载体图谱。

原始的 pLKO.1-TRC 克隆载体含有一段 1.9 kb 的“填充序列”（stuffer），可通过 AgeI 和 EcoRI 酶切释放。shRNA 寡核苷酸被克隆到 AgeI 和 EcoRI 位点，取代该填充序列。

在大多数情况下，AgeI 位点会被破坏（取决于靶序列），而 EcoRI 位点则被保留。

# 访问 www.addgene.org/10878/可查看完整的含 1.9 kb 填充序列的 pLKO.1 图谱。

图 2：shRNA与shRNA转录

相关产品 (Related Products)

以下是推荐与 pLKO.1 TRC-克隆载体联合使用的质粒。

注意：pLKO.1 也可与 Robert Weinberg 实验室的包装质粒 pCMV-dR8.2 dvpr 和包膜质粒 pCMV-VSVG 联用。也有其他多个实验室已提交了 pLKO 衍生载体，在一些其他实验场景同样有用。

二、 为 pLKO.1 设计 shRNA 寡核苷酸

1. 确定基因中的最佳 21-mer 靶点

在目标基因中选择合适的 21-mer 靶点是实现高效基因沉默的第一步。靶点选择方法在不断改进。以下是靶点选择的建议：

1.1 使用 siRNA 选择工具：确定目的基因的一组高分靶点。例如，怀特黑德生物医学研究所 (Whitehead Institute for Biomedical Research) 提供一个 siRNA 选择程序 (siRNA Selection Program)，注册后即可免费使用。

设计高效基因沉默 siRNA 的指南：

o 从起始密码子 (ATG) 下游 25 nt 处开始，寻找符合 AA(N19) 模式的 21 nt 序列。若无合适匹配，则寻找 NAR(N17)YNN 模式，其中 N 代表任意核苷酸，R 代表嘌呤 (A, G)，Y 代表嘧啶 (C, U)。

o G-C 含量应在 36-52% 之间。

o 有义链 (sense) 3' 端应具有较低的稳定性——在 15-19 位点之间至少含有一个 A 或 T。

o 避免靶向内含子 (introns)。

o 避免连续 4 个或更多核苷酸的重复序列，尤其是连续的 T，因为 polyT 是 RNA 聚合酶 III 的终止信号。

注意：这些是创建 pLKO.1 载体时的主流指南。更多设计规则可在 Broad 研究所的 TRC shRNA 设计流程 (TRC shRNA Design Process) 中找到。

1.2 最小化脱靶 mRNA 的降解：使用 NCBI 的 BLAST 程序，选择与所有非相关基因至少有 3 个核苷酸错配的序列。

提示：Addgene 建议为每个基因选择多个靶序列。某些序列会比其他序列更有效。此外，证明两个靶向同一基因的不同 shRNA 能产生相同的表型，可以减轻对脱靶效应 (off-target effects) 的担忧。

2. 订购与 pLKO.1 兼容的寡核苷酸

要生成用于克隆到 pLKO.1 的寡核苷酸，请将 B.1 步骤中获得的有义 (sense) 和反义 (antisense) 序列插入以下寡核苷酸中。不要更改两端序列；这些碱基对于将寡核苷酸克隆到 pLKO.1 TRC-克隆载体至关重要。

o 正向寡核苷酸 (Forward oligo): 5’ CCGG—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense—TTTTTG 3’

o 反向寡核苷酸 (Reverse oligo): 5’ AATTCAAAAA—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense 3’

例如，如果靶序列为 (AA)TGCCTACGTTAAGCTATAC，则寡核苷酸为：

o 正向寡核苷酸: 5’ CCGGAATGCCTACGTTAAGCTATACCTCGAGGTATAGCTTAACGTAGGCATTTTTTTG 3’

o 反向寡核苷酸: 5’ AATTCAAAAAAATGCCTACGTTAAGCTATACCTCGAGGTATAGCTTAACGTAGGCATT 3’

三、 将寡核苷酸克隆到 pLKO.1 中

pLKO.1-TRC 克隆载体含有一段 1.9 kb 的填充序列 (stuffer)，经 EcoRI 和 AgeI 酶切后可被释放。在第二部分设计的寡核苷酸包含 shRNA 序列，其两侧序列与 EcoRI 和 AgeI 产生的黏性末端兼容。正向和反向寡核苷酸退火后，被连接到 pLKO.1 载体中，从而产生表达目标 shRNA 的最终质粒。

1. 推荐材料

2. 寡核苷酸退火 (Annealing Oligos)

2.1 将寡核苷酸溶解于 ddH2O 至 20 μM 浓度，然后混合：

o 5 μL 正向寡核苷酸

o 5 μL 反向寡核苷酸

o 5 μL 10x NEB buffer 2

o 35 μL ddH2O

2.2 在 PCR 仪或沸水浴中 95°C 孵育 4 分钟。

2.3 若使用 PCR 仪，将样品在 70°C 孵育 10 分钟，然后在数小时内缓慢冷却至室温。若使用烧杯，将烧杯从热源移开，让水自然冷却至室温。此过程需数小时，但缓慢冷却是寡核苷酸成功退火的关键。

3. 酶切 pLKO.1 TRC 克隆载体

以下步骤是创建 pLKO.1 载体时的主流指南。如需替代方案，请参考酶制造商的资源，例如 NEB 的在线工具 NEBcloner，以帮助指导双酶切反应的缓冲液选择。

3.1 用 AgeI 酶切 pLKO.1 TRC-克隆载体。混合：

o 6 μg pLKO.1 TRC-克隆载体 (maxiprep 或 miniprep DNA)

o 5 μL 10x NEB buffer 1

o 1 μL AgeI

o 加 ddH2O 至终体积 50 μL

37°C 孵育 2 小时。

3.2 使用 Qiaquick 胶回收试剂盒纯化。用 30 μL ddH2O 洗脱。

3.3 用 EcoRI 酶切上一步洗脱液。混合：

o 30 μL 经 AgeI 酶切的 pLKO.1 TRC-克隆载体

o 5 μL 10x NEB buffer for EcoRI

o 1 μL EcoRI

o 14 μL ddH2O

37°C 孵育 2 小时。

3.4 将酶切后的 DNA 在 0.8% 低熔点琼脂糖凝胶上电泳，直至清晰看到两条带，一条 7kb，一条 1.9kb。切下 7kb 条带，放入无菌微量离心管中。

提示：在观察用于连接的 DNA 片段时，仅使用长波长紫外光。短波长紫外光会增加 DNA 损伤的几率。

3.5 使用胶回收试剂盒纯化 DNA。用 30 μL ddH2O 洗脱。

3.6 测量 DNA 浓度。

4. 连接与转化细菌

4.1 使用合适的连接方法。对于标准 T4 连接，混合：

o 2 μL C.2 步骤的退火寡核苷酸

o 20 ng C.3 步骤的酶切 pLKO.1 TRC-克隆载体（若无法测量 DNA 浓度，则使用 1 μL）

o 2 μL 10x NEB T4 DNA ligase buffer

o 1 μL NEB T4 DNA ligase

o 加 ddH2O 至终体积 20 μL

16°C 孵育 4-20 小时。

4.2 按照制造商的方案，将 2 μL 连接混合物转化到 25 μL DH5 alpha 感受态细胞中。涂布于含 100 μg/mL 氨苄青霉素或羧苄青霉素 (carbenicillin, 一种氨苄青霉素类似物) 的 LB 琼脂平板上。

四、筛选插入片段

可以通过限制性内切酶消化来筛选成功连接的质粒。然而，一旦确定了阳性克隆，必须通过测序反应来验证插入片段。1. 推荐材料

2. 筛选插入片段

第1天

2.1 从每个连接反应中挑取 5 个菌落，接种于含 100 μg/mL 氨苄青霉素或羧苄青霉素的 LB 培养基中。

第2天

2.2 离心收集菌液，使用小提试剂盒提取 DNA。

2.3 用 EcoRI 和 NcoI 进行限制性酶切：

o 1 μg 小提质粒 DNA

o 2 μL 10x NEB buffer for EcoRI

o 0.8 μL EcoRI

o 0.8 μL NcoI

o 加 ddH2O 至终体积 20 μL

37°C 孵育 1-2 小时。

2.4 将酶切产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳。应该能看到两个片段，一个 2kb 片段和一个 5kb 片段。

2.5 使用 pLKO.1 测序引物 (5’ CAA GGC TGT TAG AGA GAT AAT TGG A 3’) 对阳性克隆进行测序。

提示：如果 DNA 聚合酶难以读取发夹序列的二级结构，可能需要调整测序条件。

五、生产慢病毒颗粒 (Producing Lentiviral Particles)

在进行此步骤之前，必须联系所在机构的生物安全办公室，以获得许可和机构特定的操作说明。必须遵守安全规程，并在适合处理 HIV 衍生病毒的环境（例如 BL2+）中工作。

对于蛋白质表达的瞬时敲低 (transient knockdown)，可以将质粒 DNA 直接转染到目标细胞中。shRNA 会被表达，但 DNA 不太可能整合到宿主基因组中。

对于稳定的功能缺失 (stable loss-of-function) 实验，Addgene 建议生成慢病毒颗粒并感染目标细胞。添加嘌呤霉素将允许筛选出稳定表达目标 shRNA 的细胞。

图 3：慢病毒包装

1. 推荐材料

注意：pLKO.1 也可使用 Robert Weinberg 实验室的 pCMV-dR8.2 dvpr 和 pCMV-VSVG 进行包装。更多信息，请访问 Addgene 的哺乳动物 RNAi 工具页面 (Mammalian RNAi Tools page)。

2. 生产慢病毒颗粒的方案

本方案适用于 6 cm 培养皿的转染。可根据需要按比例放大或缩小以生产不同量的病毒。

第1天:

2.1 对于每个待转染的质粒，在 6 cm 组织培养皿中铺 7×10⁵ 个 HEK-293T 细胞，加入 5 mL 培养基。37°C、5% CO₂ 培养过夜。

虽然细胞常规传代时应使用含青霉素/链霉素的 DMEM + 10% FBS 培养基，但在此步骤铺板时，应使用不含抗生素（无青霉素或链霉素）的 DMEM + 10% FBS。

第2天:

2.2 在下午晚些时候进行转染，因为转染混合物与细胞的孵育时间应仅为 12-15 小时。

2.3 在聚丙烯微量离心管中（切勿使用聚苯乙烯管），为每次转染配制混合液：

o 1 μg pLKO.1 shRNA 质粒

o 750 ng psPAX2 包装质粒

o 250 ng pMD2.G 包膜质粒

o 用无血清 OPTI-MEM 定容至 20 μL

提示：可能需要调整 shRNA 质粒、包装质粒和包膜质粒的比例，以获得最佳病毒产量的比例。

2.4 在无血清 OPTI-MEM 中配制 FuGENE® 6 转染试剂的母液。根据每个反应需要 6 μL FuGENE® + 74 μL OPTI-MEM 来计算所需 FuGENE® 和 OPTI-MEM 的量。例如：

o 1x 母液: 6 μL FuGENE® + 74 μL OPTI-MEM

o 5x 母液: 30 μL FuGENE® + 370 μL OPTI-MEM

o 10x 母液: 60 μL FuGENE® + 740 μL OPTI-MEM

在聚丙烯管中，先加入 OPTI-MEM。将 FuGENE® 直接移液到 OPTI-MEM 中——在稀释前不要让 FuGENE® 接触管壁。通过旋转或轻弹管壁混匀。室温孵育 5 分钟。

2.5 向 c 步骤的每个管中加入 80 μL FuGENE® 母液，使总体积达到 100 μL。将母液直接移液到液体中，而不是管壁上。通过旋转或轻弹管壁混匀。

2.6 室温孵育 20-30 分钟。

2.7 从培养箱中取出 HEK-293T 细胞。细胞汇合度应为 50-80%，且培养基中不含抗生素。

2.8 不要触碰培养皿侧壁，轻轻地将 DNA:FuGENE® 混合液逐滴加入细胞中。轻轻旋转培养皿使混合物均匀分散。不要剧烈移液或旋转，以免将细胞从培养皿上冲落。

2.9 37°C、5% CO₂ 培养 12-15 小时。

第3天:

2.10 早上更换培养基以去除转染试剂。替换为 5 mL 新鲜的 DMEM + 10% FBS + 青霉素/链霉素。将培养基沿培养皿侧壁加入，以免扰动转染的细胞。

2.11 37°C、5% CO₂ 培养 24 小时。

第4天:

2.12 收集细胞培养上清，转移至聚丙烯储存管中。该上清即含有慢病毒颗粒。4°C 保存。

2.13 向细胞中加入 5 mL 含抗生素的新鲜培养基，37°C、5% CO₂ 培养 24 小时。

第5天:

2.14 收集细胞培养上清，与第 4 天的上清混合。1,250 rpm 离心 5 分钟，沉淀收获过程中意外收集的 HEK-293T 细胞。

提示：作为离心的替代方案，可以通过 0.45 μm 滤器过滤培养基以去除细胞。不要使用 0.2 μm 滤器，因为它可能会剪切病毒的包膜。

2.15 病毒可在 4°C 保存数天，但长期储存应置于 -20°C 或 -80°C。

提示：冻融循环会降低病毒效价，建议立即使用病毒，或将培养基分装到小管中，以避免多次冻融。

六、 感染目标细胞 (Infecting Target Cells)

慢病毒颗粒可以高效感染多种细胞类型，包括分裂和非分裂细胞。添加嘌呤霉素将允许筛选出稳定表达目标 shRNA 的细胞。

1. 推荐材料

* 详细的聚凝胺 (polybrene)、鱼精蛋白硫酸盐 (protamine sulfate) 和嘌呤霉素 (puromycin) 配制方案位于“附录”(Appendix) 中。

2. 确定最佳嘌呤霉素浓度

每种细胞系对嘌呤霉素筛选的反应不同。建议在开始实验前，确定细胞系的最佳嘌呤霉素浓度。

第1天:

2.1 在十个 6 cm 培养皿中铺板目标细胞，37°C、5% CO₂ 培养过夜。

第2天:

2.2 目标细胞汇合度应约为 80-90%。

2.3 用目标细胞的首选培养基稀释嘌呤霉素。嘌呤霉素的终浓度范围为 1-10 μg/mL，以 1 μg/mL 为增量。

2.4 将培养皿标记为 1-10，并向细胞中加入相应浓度的含嘌呤霉素培养基。

第3天及以后:

2.5 每天观察细胞，并每隔一天更换新鲜的含嘌呤霉素培养基。

2.6 在 3-5 天内导致细胞完全死亡的最低嘌呤霉素浓度，即为实验中应使用的筛选浓度。（可用更精细的嘌呤霉素增量重复此滴定，以确定更精确的最佳浓度。）

3. 慢病毒感染与筛选方案

第1天:

3.1 铺板目标细胞，37°C、5% CO₂ 培养过夜。

第2天:

3.2 目标细胞汇合度应约为 70%。更换为含 8 μg/mL 聚凝胺 (polybrene) 的新鲜培养基。

提示：聚凝胺可提高病毒感染效率。然而，聚凝胺对某些细胞系有毒。在这些细胞系中，可用鱼精蛋白硫酸盐 (protamine sulfate) 替代聚凝胺。

3.3 加入第五部分制备的慢病毒颗粒溶液。对于 6 cm 目标培养皿，加入 0.5–1 mL 病毒（高 MOI 加 0.5 mL，低 MOI 加 0.1 mL）。根据目标培养皿的大小调整病毒用量。

提示：MOI (multiplicity of infection, 感染复数) 指的是每个细胞感染的病毒颗粒数量。建议测试一系列 MOI，以确定目标细胞系中感染和基因沉默的最佳 MOI。

3.4 37°C、5% CO₂ 培养过夜。

第3天:

3.5 感染后 24 小时更换为新鲜培养基。

提示：如果在细胞系中观察到病毒毒性，可将感染时间缩短至 4–20 小时。移除含病毒的培养基，替换为新鲜培养基。在感染后至少 24 小时再添加嘌呤霉素，以确保嘌呤霉素抗性基因有足够时间表达。

3.6 为了筛选感染细胞，向培养基中加入确定浓度的嘌呤霉素。

建议同时保留一块未感染的细胞平板作为平行对照。该平板将作为嘌呤霉素筛选的阳性对照。

第4天及以后:

3.7 每隔几天根据需要更换新鲜的含嘌呤霉素培养基。

3.8 检测感染细胞。以下建议是在收获细胞前应等待天数的指南。但应根据细胞系和检测方法优化时间：

七、 安全 (Safety)

在制备和操作慢病毒颗粒时，应遵循 BL2 级生物安全规范。必须始终穿戴个人防护服。使用塑料移液器代替玻璃移液器或针头。液体废物应用至少 10% 的漂白剂进行消毒。接触过病毒颗粒的实验室材料应作为生物危害废物处理并进行高压灭菌。请遵循所在机构以及 CDC 和 NIH 关于在 BL2 设施中工作的所有安全指南。

如果对应遵循何种安全规范有任何疑问，应及时联系所在机构的安全办公室。

图 4：生物安全

八、 附录 (Appendix)

1. pLKO.1 TRC-克隆载体序列

点击此处查看 pLKO.1 TRC-克隆载体的序列。该载体总长为 8901 个碱基对，填充序列 (stuffer insert) 以大写字母显示。

2. 配方 (Recipes)

2.1 Luria Broth 琼脂 (LB agar) + 抗生素

根据 American Bioanalytical 货号 # AB01200-02000 的 40 克粉末，LB 成分为：

o 10g 胰蛋白胨 (tryptone)

o 5g 酵母提取物 (yeast extract)

o 10g 氯化钠 (sodium chloride)

o 15g 琼脂 (agar)

配制 LB 琼脂溶液：将 40g LB 粉末溶于 1L 蒸馏水中。高压灭菌后冷却至 55°C。加入 1mL 100mg/mL 的氨苄青霉素或羧苄青霉素，使抗生素终浓度达到 100 μg/mL。倒平板并于 4°C 保存。

2.2 溴化己二甲铵 (聚凝胺, Hexadimethrine Bromide (Polybrene))

用 0.9% NaCl 配制 1mg/mL 的聚凝胺 (Sigma-Aldrich 货号 #H9268) 溶液。高压灭菌以灭菌。母液在 4°C 下可稳定保存长达一年。聚凝胺粉末在 4°C 下可稳定保存数年。

2.3 鱼精蛋白硫酸盐 (Protamine Sulfate)

鱼精蛋白硫酸盐 (MP Biomedicals 货号 #194729) 于 4°C 保存。易溶于热水，微溶于冷水。

2.4 嘌呤霉素 (Puromycin)

用蒸馏水配制 50mg/mL 的嘌呤霉素 (Sigma-Aldrich 货号 #P8833) 母液。通过 0.22 μm 滤器过滤除菌。分装后于 -20°C 保存。

参考文献与相关资料

https://www.addgene.org/

Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Khvorova A et. al. Cell. 2003. 115:209-216.PubMed.

A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Moffat J et. al. Cell. 2006. 124:1283-1298.PubMed.

In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Naldini L et. al. Science. 1996 272:263-267.PubMed.

Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Schwarz DS et. al. Cell. 2003. 115:199-208.PubMed.

Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. Stewart SA et. al. RNA. 2003. 9(4):493-501.PubMed.

Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Zufferey R et. al. Nat Biotechnol. 1997. 15(9):871-5.PubMed.

Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. Zufferey R et. al. J Virol. 1998. 72(12):9873-80.PubMed.

Addgene 的哺乳动物 RNAi 网站: www.addgene.org/mammalianrnai

RNAi 联盟 (TRC): www.broad.mit.edu/genome_bio/trc/rnai.html

RNAi 机制背景: RNAi animation

怀特黑德 siRNA 选择程序: http://sirna.wi.mit.edu/

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更新日期：2026-04-19

编制人：磊子

审稿人：小藻