严格厌氧嗜热微生物的培养与鉴定技术综述
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：27 发布时间：2026-03-25 21:03:41
摘要
严格厌氧嗜热微生物（strictly anaerobic thermophilic microorganisms）的培养与鉴定面临诸多挑战，主要归因于这类物种对氧气的高度敏感性。
本章系统综述了厌氧环境的特性、当前用于培养耐氧（aerotolerant）及严格厌氧细菌（strictly anaerobic bacteria）的关键技术，
并重点介绍了无需培养即可鉴定嗜热细菌的分子生物学方法（molecular methods）。
一、引言
尽管人类对生命的认知常以“需氧”为视角，但栖息于沉积物、温泉及工业废液等厌氧环境中的微生物，在生物圈的碳、氮、硫循环中发挥着不可替代的作用。
然而，尽管这些微生物具有极高的临床价值、生态意义及生物技术潜力，标准本科微生物学教材却鲜少详细阐述专性厌氧（obligatory anaerobes）和严格厌氧微生物的培养技术。
这导致学生虽知晓需在缺氧条件下操作，却往往缺乏掌握该技能所需的深层理论支撑。
过去40年间，厌氧微生物研究技术虽有延续，但也取得了突破性进展。
早期经典著作如《厌氧实验室手册》曾详述利用加热铜催化剂除杂及套管（cannulas）导气等技术，而现代技术已在此基础上大幅优化。
厌氧微生物在地球上无处不在，甚至可能在大氧化事件（great oxygenation event）之前就已繁盛。此处需明确区分两个概念：
- 专性厌氧菌（Obligate anaerobes）：不能利用分子氧，但能耐受环境中一定浓度的氧气。
- 严格厌氧菌（Strict anaerobes）：接触氧气即死亡。研究表明，当溶解氧浓度超过 5 μM 时，严格厌氧细菌便无法生长。
由于分子氧及其衍生物（如活性氧）的毒性，研究具有临床或应用价值的厌氧菌必须在严格无氧条件下进行。
这不仅要求彻底去除氧气，还需降低培养基的氧化还原电位（redox potential），以营造足够强的还原环境来保护其辅酶系统。
自路易斯·巴斯德（Louis Pasteur）在19世纪中叶提出“厌氧”概念以来，相关操控技术已极大推动了溶剂生产、生理学研究及微生物生态学的发展。
历史上，由于方法学限制，许多厌氧菌的应用长期被忽视。
例如，从菘蓝（Isatis tinctoria）中提取靛蓝染料的古老工艺中，最后一步是由一种名为 Clostridium isatidis 的中度嗜热严格厌氧菌完成的，它在52°C厌氧条件下将前体转化为水溶性隐色靛蓝。
本章将分为两大部分：一是嗜热厌氧菌（侧重严格厌氧菌）的通用培养技术；二是基于分子方法的厌氧嗜热微生物鉴定技术。
二、氧气的毒性机制
氧气作为末端电子受体虽普遍存在，但其强氧化性对生物体构成潜在威胁。在光照或过渡金属（铁、锰、钴等）催化下，氧气可发生自由基反应，生成超氧化物、过氧化物及羟基自由基等活性氧物种（Reactive Oxygen Species, ROS）。
这些ROS能氧化脂质、蛋白质和核酸等关键生物大分子，造成细胞损伤。下图（图1）显示了在氧气存在下形成的主要有毒化合物，尽管许多次级活性氧物种（ROS）也可能形成。
图1. 分子氧形成活性氧物种的过程
由于其能够对脂质、蛋白质和核酸等主要生物分子造成氧化损伤，ROS 对生物系统尤为令人担忧。
因此，许多好氧和耐氧生物已经开发了特定的机制来减轻活性氧物种的形成。以下是一些处理有害 ROS 最常用的机制：
- 过氧化氢酶 (Catalase): H₂O₂ + H₂O₂ → 2H₂O + O₂
- 过氧化物酶 (Peroxidase): H₂O₂ + NADH + H⁺ → 2H₂O + NAD⁺
- 超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase): O₂·⁻ + O₂·⁻2H⁺ → H₂O₂ + O₂
- 超氧化物歧化酶/过氧化氢酶联用: 4O₂·⁻ + 4H⁺ → 2H₂O + 3O₂
- 超氧化物还原酶 (Superoxide reductase): O₂·⁻ + 2H⁺ + Cytochrome C(reduced) → H₂O₂ + Cytochrome C(oxidized)
严格厌氧菌的困境：大多数严格厌氧菌缺乏上述防御酶系。
乳酸菌（LAB）是个特例，虽属严格厌氧类群，但因能产生高活性过氧化氢酶和过氧化物酶，表现出极强的耐氧性（aerotolerant），甚至可进行呼吸代谢。
厌氧菌的耐氧程度各异：有的仅是不生长但可存活，有的则是微好氧菌（microaerophilic，需低氧环境）。
梭菌纲（Class Clostridia）多为严格厌氧，但部分厚壁菌门（Firmicutes）可通过形成内生孢子（endospore）抵御氧气胁迫。
尽管对氧气敏感，许多严格厌氧细菌在生物技术中发挥着重要作用（见表1）。引起疾病的严格厌氧细菌的例子包括：肉毒梭菌（C. botulinum，肉毒中毒）、艰难梭菌（C. difficile，肠炎）、产气荚膜梭菌（C. perfringens，气性坏疽）、破伤风梭菌（C. tetani，破伤风）和牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis，牙龈炎的病原体）。
许多嗜热厌氧菌也展示了多样化的生物技术潜力，如表1所示。
表1. 具有生物技术相关性的部分厌氧微生物（嗜热微生物已加粗显示）
| 厌氧菌 (Anaerobe) | 特征 (Features) | 与氧气的关系 (O₂ relationship) | 备注 (Notes) | 参考文献 (Refs) |
|---|---|---|---|---|
| Cl. isatidis(慈蓝梭菌) | 靛蓝生产 | 严格厌氧菌 | 中度嗜热菌 | Padden et al. (1999) |
| Cl. acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌) | 丁醇 | 严格厌氧菌 | 嗜温菌 | Delarouzee et al. (2023) |
| Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌) | 丁醇 | 严格厌氧菌 | 嗜温菌 | Krishna et al. (2022) |
| T. ethanolicus(乙醇热厌氧杆菌) | 利用多种己糖和戊糖生产乙醇 | 严格厌氧菌 | 嗜热菌 | Wiegel and Ljungdahl (1981) |
| Cl. thermocellum(热纤梭菌) | 纤维素降解 | 严格厌氧菌 | 产生纤维小体用于生物质解构 | Akinosho et al. (2014) |
| Caldicellulosiruptor saccharolyticus(蔗糖高温单胞菌) | 纤维素降解、产氢 | 严格厌氧菌 | Willquist et al. (2011) | |
| P. gingivalis(牙龈卟啉单胞菌) | 病原体 | 严格厌氧菌 | 牙龈炎的致病因子 | Lamont and Jenkinson (1998), Takada and Hirasawa (1998) |
| Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum(热嗜糖热厌氧杆菌) | 利用多种己糖和戊糖生产乙醇 | 严格厌氧菌 | 从变质罐头食品中分离 | McClung (1935), Collins et al. (1994) |
| Methanobacterium formaicicum(甲酸甲烷杆菌) | 甲烷生产 | 严格厌氧菌 | 对种间氢转移很重要 | Chellapandi et al. (2018) |
| Streptococcus pyogenes(化脓性链球菌) | 病原体 | 耐氧菌 | 上呼吸道 | Avire et al. (2021) |
| Spirillum volutans(卷曲螺菌) | 淡水 | 微好氧菌 | 革兰氏阴性 | Padgett et al. (1982) |
三、厌氧细菌的培养技术
3.1 氧化还原电位（ORP/Eh）的关键作用
培养厌氧菌的核心在于控制培养基的氧化还原电位（Redox Potential, ORP 或 Eh）。仅去除氧气往往不够，必须通过添加还原剂将电位降至足够低的水平，严格厌氧菌方能生长。
- 监测方法：溶解氧（dO2）可用传感器测量，但培养物氧化还原电位（CRP）的监测更为关键且便捷，常用铂电极测定。
- 氧化还原指示剂：在小规模实验中，电极法较繁琐，常使用氧化还原敏感染料（显色团），市面上有大量的氧化还原敏感染料可供选择（见表2）：
表2. 常用氧化还原指示剂的选定中点电位及其他特征
| 染料 (Dye) | 中点电位 (Em, mV) | 备注 (Notes) |
|---|---|---|
| 亚甲基蓝 (Methylene blue) | 11 | 常见，廉价 |
| 试卤灵 (Resorufin) | -51 | 低毒性，用于活力测定 |
| 靛蓝三磺酸盐 (Indigo) | -81 | |
| 尼罗蓝 (Nile blue) | -142 | |
| 甲酚紫 (Cresyl violet) | -167 | |
| 亮茜素蓝 (Brilliant alizarin blue) | -173 | |
| 中性蓝 (Neutral blue) | -192 | |
| 吩嗪藏红 (Phenosafranine) | -252 | |
| 藏红-T (Safranine-T) | -289 | |
| 中性红 (Neutral red) | -325 | |
| 苄基紫精 (Benzyl viologen) | -359 | 廉价，呼吸道刺激物 |
| 甲基紫精 (Methyl viologen) | -440 | 廉价，剧毒 |
| 标准氢电极 (Standard hydrogen electrode) | -421 |  图2. 亚甲基蓝及其还原为无色亚甲基蓝的过程  图3. 刃天青是一种常用于厌氧培养基的氧化还原指示剂，它会发生不可逆还原，由蓝色变为粉色（试卤灵）；而试卤灵可进一步发生可逆还原，变为无色形式（二氢试卤灵）。 |
3.2 严格厌氧培养基的制备
首选成分明确的矿物培养基，以减少非目标代谢产物的干扰。制备流程需严格除氧：
- 除氧处理：煮沸培养基以驱除溶解氧，随即在惰性气体（氮气、氩气或氦气）流保护下迅速冷却。
- 分装与密封：在无氧气流保护下，将培养基转移至血清瓶或亨盖特管（Hungate tubes）。建议使用长针头深入液面下鼓泡。
- 灭菌：121°C 高压灭菌至少 15 分钟。
- 添加热敏感成分：碳源（如葡萄糖）、维生素、微量元素及还原剂需在灭菌后加入。
表3. 厌氧培养基中常用的还原剂
| 还原剂 (Reducing agent) | 典型浓度 (Typical) | 还原电位 (Reduction potential, mV) |
|---|---|---|
| Ti³⁺（钛离子） | -660 | |
| 连二亚硫酸盐（S₂O₄²⁻） | -480 | |
| 抗坏血酸 (Ascorbic acid) | 0.05% w/v | 58 |
| Na₂S·9H₂O（九水硫化钠） | 0.05% w/v | -243 |
| FeS（amorphous）（无定形硫化亚铁） | 4 μg/mL | ≤270 |
| Cysteine-HCl（盐酸半胱氨酸） | 0.05% w/v | -325 |
| Sodium thioglycolate (HSCH₂COONa)（巯基乙酸钠） | 0.05% w/v | -140 |
| Titanium (III) citrate（柠檬酸钛(III)） | 1 - 4 mM | -480 |
| H₂ + PdCl₂（氢气 + 氯化钯） | Variable（可变） | -413 |
| Dithiothreitol（二硫苏糖醇） | 1 mM | -330 |
| Cysteine-HCl（盐酸半胱氨酸） |
3.3 灭菌策略与污染控制
嗜热菌培养虽减少了嗜温菌污染风险，但增加了耐热菌（如 Geobacillus stearothermophilus）的污染隐患（表4）。
- D值警示：某些热厌氧菌（如 Thermoanaerobacter pseudethanolicus）的耐热性极强，其 D₁₂₁°C 值可达 11 分钟。若初始菌量高，传统 15 分钟灭菌程序可能不足。
- 推荐方案：作者团队建议培养基灭菌 60 分钟，废弃培养物及玻璃器皿灭菌 120 分钟，并辅以 250°C 干热灭菌 4 小时。
对于含土壤样本或孢子的实验，必要时可采用廷达尔灭菌法（Tyndallization）。
表4. 部分嗜温和嗜热产孢细菌的D值
| 微生物 (Microorganism) | 最适生长温度 (Topt, ℃) | 121℃下的D值 (min) |
|---|---|---|
| Clostridium thermocellum (热纤梭菌) | 55 | 0.5 |
| Thermoanaerobacterium (产硫热厌氧杆菌) | 60 - 70 | 2.5 |
| Thermoanaerobacter (假乙醇热厌氧杆菌) | 65 | 11 |
| Desulfotomaculum (黑脱硫肠状菌) | 55 | 5.6 |
| Bacillus subtilis (枯草芽孢杆菌) | 35 | 0.9 |
| Geobacillus (嗜热脂肪地芽孢杆菌，菌株) | 55 | 3 |
| Clostridium sporogenes (生孢梭菌) | 37 | 1.3 |
3.4 耐氧厌氧菌的培养
对于耐氧菌，技术要求相对宽松：
- 液体培养：覆盖矿物油或石蜡层隔绝空气，或使用深部静置培养。
- 固体培养：可使用厌氧罐（Anaerobic jars，内置钯催化剂除氧）（图4）或厌氧袋。但需注意，厌氧罐残留的微量氧气可能不足以支持严格厌氧菌生长。
- 高级设备：专业实验室常配备厌氧手套箱（Anaerobic chambers/Glove boxes），内部充满 N₂/CO₂ 混合气，通过钯催化剂循环除氧，可实现全程无氧操作。
图4. 用于培养厌氧微生物的商品化厌氧罐
3.5 严格厌氧菌的培养：亨盖特技术与巴尔奇技术
严格厌氧菌的培养需遵循严苛的无氧操作规范，核心是亨盖特技术（Hungate technique）及其改进版巴尔奇技术（Balch technique）（图5）：
- 介质无氧化：煮沸或蒸汽灭菌过程中持续通入无氧气体。
- 还原环境构建：加入硫化物、钛(III)离子等强还原剂。
- 专用器具：使用丁基橡胶塞（低透气性）和铝盖密封的血清瓶或滚管（Roll tubes）。
- 操作流程：培养基煮沸冷却至 40°C 以下 → 加还原剂 → 无氧气流下分装 → 密封 → 灭菌（或先灭菌后无氧添加成分）。
- 特殊处理：针对难杀灭的耐热孢子，可采用“灭菌 - 孵育 - 再灭菌”的双重灭菌策略。
图5. 装有基础矿物培养基的血清瓶 (a) 和亨盖特管 (b)
四、非培养鉴定技术：分子生物学方法
传统培养方法仅能获取自然界中约 1% 的微生物（“大平板计数异常”现象）。为探索庞大的“未培养部分”，分子生物学技术应运而生。
4.1 群落部分分析技术
此类技术针对特定基因片段或标记物进行分析：
- DGGE/TGGE（变性/温度梯度凝胶电泳）：基于DNA熔解特性分离片段，用于分析群落多样性。例如，研究发现温度是决定地热泉微生物群落结构的关键因子。
- SSCP（单链构象多态性）：快速筛查基因组变异，适用于产甲烷菌等特定类群的结构多样性分析。
- DNA 微阵列 (Microarrays)：高通量检测特定基因的存在与表达，区分活跃菌群与死菌。
- qPCR (实时荧光定量 PCR)：精确定量特定功能基因（如氢化酶基因）的拷贝数。
- FISH (荧光原位杂交)：利用荧光探针在显微镜下直接观察特定微生物的空间分布。例如，在菲律宾火山泥泉中，FISH 揭示了古菌占主导地位。
4.2 全群落分析技术
此类技术提供全景式的基因组信息：
- 全基因组测序 (WGS)：已完成多种具有生物能源潜力的嗜热厌氧菌（如 Thermoanaerobacter, Caldicellulosiruptor）的全基因组测序。
- 宏基因组学 (Metagenomics)：
- 宏转录组学 (Metatranscriptomics)：分析群落基因表达谱，揭示不同温度下微生物的代谢活性差异。
- 宏蛋白质组学 (Metaproteomics)：直接鉴定群落中的蛋白质，验证功能活性。研究显示，在纤维素厌氧消化中，Caldicellulosiruptor 和 Clostridium 是主要的降解者。
五、结语
自 20 世纪 60 年代亨盖特奠定厌氧培养基础以来，虽然核心原理未变，但我们对氧气毒性机制的理解已大幅深化，针对极端嗜热菌的灭菌与培养 protocol 也更为严谨。与此同时，分子生物学技术的飞跃式发展，使我们能够绕过培养瓶颈，深入解析嗜热厌氧菌在自然及人工生态系统中的多样性和功能角色。未来，结合传统培养与现代组学技术，将进一步释放这类微生物在生物能源、环境治理及医药领域的巨大潜力。
参考文献
1.Akinosho H, Yee K, Close D et al (2014) The emergence of Clostridium thermocellum as a high utility candidate for consolidated bioprocessing applications. Front Chem 2:66. https://doi.org/ 10.3389/fchem.2014.00066
2.Baughn AD, Malamy MH (2004) The strict anaerobe Bacteroides fragilis grows in and benefits from nanomolar concentrations of oxygen. Nature 427(6973):441–444.https://doi.org/10.1038/ nature02285
3.Chellapandi P, Bharathi M, Sangavai C et al (2018) Methanobacterium formicicum as a target rumen methanogen for the development of new methane mitigation interventions: a review. Vet Anim Sci 6:86–94. https://doi.org/10.1016/j.vas.2018.09.001
4.Krishna KV, Bharathi N, Malaviya A (2022) An updated review on advancement in fermentative production strategies for biobutanol using Clostridium species. Environ Sci Pollut Res 29: 47988–48019. https://doi.org/10.1007/s11356-022-20637-9
5.Najar IN, Sherpa MT, Das S et al (2020) Diversity analysis and metagenomic insights into the antibiotic resistance and metal resistances among Himalayan hot spring bacteriobiomeinsinuating inherent environmental baseline levels of antibiotic and metal tolerance. J Glob Antimicrob Res 21:342–352. https://doi.org/10.1016/j.jgar.2020.03.026
6.Verma G, Kumar V, Satyanarayana T (2022) Genomic attributes of thermophilic and hyperthermophilic bacteria and archaea. World J Microbiol Biotechnol 38:8.https://doi.org/10.1007/ s11274-022-03327-z
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更新日期：2026-03-19
编制人：思琪
审稿人：小藻