分子实验笔记15：通过退火寡核苷酸进行质粒修饰（Plasmid Modification by Annealed Oligo Cloning）

概述（Summary）

寡核苷酸重叠克隆（Oligo overlap cloning）适用于向质粒中插入一段短DNA序列的多种场景，例如：

• 改造多克隆位点（Multiple Cloning Site, MCS）；
• 添加短标签（short tags），如HA标签或Flag标签；
• 克隆shRNA序列。

背景（Background）

本教程以向空载体的MCS中引入新的限制性酶切位点为例进行说明。但该技术同样适用于在任意载体中添加短标签或shRNA（仅引物设计部分有所不同）。

假设您常用的载体MCS较为有限（例如：BamHI–EcoRI–SalI），而您希望在其间插入NdeI、PacI、AscI和MfeI四个新位点。通过寡核苷酸重叠克隆，可设计包含这些位点的寡核苷酸对，并将其直接插入现有载体中。虽然需耗时数日，但一旦构建成功，将长期受益。

设计（Design）

简言之，我们设计一对具有重叠区域的寡核苷酸（oligos），退火后形成的双链片段两端可与原始载体经EcoRI和SalI双酶切产生的黏性末端互补，从而直接连接入载体。

图1：设计重叠寡核苷酸

寡核苷酸设计（Designing oligos）

为在载体EcoRI与SalI位点之间插入NdeI（CATATG）、PacI（TTAATTAA）、AscI（GGCGCGCC）和MfeI（CAATTG）位点，设计如下寡核苷酸：

初始核心序列（28 bp）：

• 正向寡核苷酸（Top oligo）：
  5'-CATATGTTAATTAAGGCGCGCCCAATTG-3'
• 反向互补寡核苷酸（Bottom oligo）：
  3'-GTATACAATTAATTCCGCGCGGGTTAAC-5'

为匹配EcoRI（产生5'-AATT突出）和SalI（产生5'-TCGA突出）酶切后的黏性末端，需在两端补充额外碱基：

• 正向寡核苷酸5'端加 AATTC，3'端加 G；
• 反向寡核苷酸5'端加 TCGAC，3'端加 C（注意：实际合成时通常以5'→3'方向书写）。

最终得到34 bp的寡核苷酸对：

• 正向寡核苷酸：
  5'-AATTCCATATGTTAATTAAGGCGCGCCCAATTGG-3'
• 反向寡核苷酸（按5'→3'方向书写）：
  5'-TCGACCAATTGGGCGCGCCTTAATTAACATATGG-3'

注意：若省略两端的G/C碱基，虽可简化设计，但会导致最终载体中EcoRI和SalI位点被破坏。保留这些碱基可维持原有酶切位点完整性。

请向您常用的寡核苷酸合成公司订购以下两条序列（均为5'→3'方向）：

• Top oligo：
  5'-AATTCCATATGTTAATTAAGGCGCGCCCAATTGG-3'
• Bottom oligo：
  5'-TCGACCAATTGGGCGCGCCTTAATTAACATATGG-3'

重要提示：若计划对酶切后的载体进行磷酸酶处理（phosphatase treatment，防止自连），则必须使用5'端磷酸化寡核苷酸（5'-phosphorylated oligos）。订购时可选择此修饰选项，或后续通过T4多核苷酸激酶（PNK）进行酶促磷酸化。

实验流程（Experimental Procedure）

1. 酶切并纯化载体（Digest and purify vector）

1. 在等待寡核苷酸到货期间，取1 μg载体，用EcoRI和SalI进行双酶切；
2. 琼脂糖凝胶电泳后，切下含线性化载体的条带；
3. 使用商业试剂盒或标准方法进行凝胶纯化（gel purification）。

2. 寡核苷酸退火（Anneal oligos）

将寡核苷酸溶解于退火缓冲液（10 mM Tris, pH 7.5–8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA）中，按等摩尔浓度混合。建议每种寡核苷酸各取2 μg，总体积调至50 μL（必要时补加退火缓冲液）。

可通过以下任一方法实现高效退火：

方法一（热块法）：

• 将混合液加入1.5 mL离心管；
• 置于90–95°C金属浴中孵育3–5分钟；
• 移开热源（关闭加热或移至实验台），让其自然缓慢冷却至室温（约45分钟）。

方法二（PCR仪法）：

• 将混合液加入PCR管；
• 放入PCR仪，程序设置为：95°C 2分钟，随后在45分钟内逐步降温至25°C。

3. 连接反应（Ligation）

1. 取5 μL退火产物，用45 μL无核酸酶水稀释，测定浓度（预期约8 ng/μL）；
2. 在标准连接反应体系中，将退火双链寡核苷酸与线性化载体按摩尔比（vector:insert）混合。例如：将50 bp插入片段连接至5 kb载体时，可使用100 ng载体搭配0.75–6 ng退火寡核苷酸；
3. 取2–3 μL连接产物转化至感受态细菌，涂布抗性平板。
4. 务必挑取多个单菌落进行小提质粒（mini-prep），并通过测序确认插入序列的正确性。

图2：连接反应

参考文献

https://www.addgene.org/

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更新日期：2026-02-27

编制人：磊子

审稿人：小藻