分子实验笔记14：不依赖连接酶的克隆（Ligation Independent Cloning, LIC）

概述（Overview）

不依赖连接酶的克隆（Ligation Independent Cloning, LIC）省去了传统克隆方法中耗时的连接（ligation）步骤。

在传统克隆中，短片段间的碱基配对（通常仅4 bp）不足以在转化和复制过程中维持质粒结构的稳定性。

而LIC利用长单链突出端（long overhangs，通常10–12 bp）形成稳定的片段间结合，从而无需连接即可直接进行转化。

最终，这种虽已退火但存在切口（nicked）的环状载体可在宿主细胞的DNA复制过程中被修复。

LIC常用T4 DNA聚合酶（T4 DNA polymerase），该酶兼具外切酶（exonuclease）与聚合酶（polymerase）活性，可根据特定序列生成长度可控的单链突出端。

用于LIC的空载体通常采用II型限制性内切酶（type II restriction enzymes，如BsaI），这类酶在其识别位点外一定距离处切割DNA。

使用单一酶即可产生多种不同的突出端，并且在最终产物中**完全去除酶切位点**，实现“无痕克隆”（no "cloning scars"）。

载体中常包含一段“填充序列”（stuffer sequence），便于通过电泳将线性化载体与酶切副产物分离；

该序列还可作为反向筛选标记（counter-selection marker），例如图中所示的sacB基因，可有效抑制非重组克隆的生长。

LIC专用载体的生产商通常会提供一段同源序列（homologous sequence），需将其整合到PCR引物的5'端。下文以质粒pNIC28-Bsa4为例，说明LIC实验设计流程。

图1：pNIC28-Bsa4

操作流程（Protocol）

步骤1：引物设计（Design Your Primers）

LIC引物设计通常只需将载体厂商提供的前导序列（leader sequence）与目标基因序列融合即可，注意保持与起始密码子或标签序列（如His-tag）的阅读框一致（in frame）。

引物长度取决于T4 DNA聚合酶的“回切”（chew back）反应机制：反应体系中仅加入一种脱氧核苷三磷酸（dNTP），可终止外切酶活性并触发聚合酶活性。

本例中使用dGTP，因此T4 Pol会从3'端逐个切除碱基，直至遇到第一个G（图中蓝色标出），此时酶会重新加上该G并停滞。因此，引物必须以紧随其后的T开头，以确保最终组装无缺口。

通常，引物包含15 bp同源序列 + 至少18 bp模板特异性序列。正向（5'）与反向（3'）引物的前导序列不同，但均遵循相同原则——即与酶切位点下游第一条链上首个G之前的序列互补。

为简化说明，此处仅展示5'引物设计。

图2：引物设计

注意：建议使用在线引物设计工具，确保PCR引物的熔解温度（Tm）在50–60°C之间。

步骤2：线性化载体（Linearize Vector）

本例中，载体经BsaI酶在两个位点切割，移除“填充序列”及sacB反向筛选标记（参见我们的限制性酶切实验方案）。

酶切完成后，需通过琼脂糖凝胶电泳分离线性化载体，并进行凝胶纯化。酶切后载体末端结构如下所示：

图3：线性化载体

注意：为确保后续反应的离子强度适宜，请使用无菌水（sterile water）而非TE缓冲液洗脱纯化的酶切产物和PCR产物。

步骤3：制备载体单链突出端（Create Vector Overhangs）

按照厂商说明书，用T4 DNA聚合酶处理线性化载体，使其3'端发生“回切”。

本反应体系中仅加入dGTP（不添加其他dNTPs），促使酶持续发挥外切活性，直至遇到序列中的第一个G。

由于聚合酶活性优先于外切活性，酶会重新加入该G并停滞，从而形成确定长度的单链突出。

图4：制备载体单链突出端

典型T4 Pol反应体系如下（总体积40 μl）：

混匀各组分（最后加入T4酶），室温孵育30分钟，随后75°C加热20分钟以灭活酶活性。

步骤4：PCR扩增插入片段（Amplify Insert by PCR）

按所用高保真聚合酶说明书进行插入片段的PCR扩增。**关键步骤**：必须彻底去除PCR产物中残留的游离dNTPs，否则会干扰下一步T4 Pol的外切活性。推荐通过凝胶纯化实现此目的。

图5：PCR扩增插入片段

步骤5：制备插入片段单链突出端（Create Insert Overhangs）

用T4 DNA聚合酶处理纯化的PCR产物，但本次反应中加入的是dCTP（而非dGTP），以匹配载体酶切后5'端暴露的第一个碱基（图中蓝色所示）。

反应同样可通过75°C加热20分钟终止。

图6：制备插入片段单链突出端

步骤6：退火与转化（Anneal and Transform）

将处理后的载体与插入片段按1:2 或 1:3 的摩尔比混合，每管退火反应使用20–50 ng载体，总体积应小于5 μl（不额外加水）。

建议固定载体量，设置多个不同插入片段浓度的反应，以提高成功率。同时设立“仅载体”对照（用水替代插入片段）。

室温孵育5分钟，加入1 μl 25 mM EDTA（螯合Mg²⁺以彻底终止酶活），再室温孵育5分钟。退火产物即可用于转化。按标准流程，取1–2 μl退火反应液转化感受态细胞。

图7：退火与转化

参考文献

https://www.addgene.org/

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更新日期：2026-03-27

编制人：磊子

审稿人：小藻