分子实验笔记13：Gibson Assembly 克隆（Gibson Assembly Cloning）

引言（Introduction）

2009年，J. Craig Venter研究所的Daniel Gibson博士及其同事开发了一种新颖的方法，用于高效组装多个线性DNA片段（Gibson et al., 2009）。

无论片段长度或末端兼容性如何，多个具有重叠序列的DNA片段均可在**单管、等温反应**（single isothermal reaction）中一步拼接。

该方法利用三种不同酶的协同作用，最终产物为**完全连接的双链DNA分子**。这一技术已被证明是构建质粒的高效手段，现已被分子生物学家广泛采用。

为何选择Gibson克隆？（Why Gibson Cloning?）

• 无需特定限制性酶切位点（restriction sites）：可连接几乎任意两个DNA片段，不受序列限制；
• 无缝连接（No scar）：拼接处无额外碱基残留；
• 步骤简便：单管反应，操作流程短；
• 多片段同步组装：可一次性连接多个DNA片段。

Gibson 克隆

操作流程（Procedure）

1. 设计质粒并订购引物（参见下方示意图）
   设计时需明确最终质粒由哪些DNA片段拼接而成。相邻片段末端应包含**相同的重叠序列**（如图中序列A和B）。这些重叠区可通过PCR引入：引物5'端包含与相邻片段匹配的序列，3'端则与目标模板退火。
   

1. 通过PCR扩增各DNA片段。

图3：通过PCR扩增各DNA片段

1. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确认大小与产量。若存在明显非特异条带，需进行凝胶纯化；若产物单一，可直接使用PCR纯化产物，甚至未经纯化的PCR反应液（raw PCR mix）也可用于组装以节省时间。
2. 在冰上配制Gibson Assembly反应体系，加入各DNA片段。
   
3. 将反应产物转化至感受态细菌，并通过限制性酶切筛选正确重组质粒。
4. 对最终质粒的关键区域进行测序验证，尤其是各组装片段的连接处（seams）。

小技巧（Tips and Troubleshooting）

1. 使用寡核苷酸“缝合”片段（“Stitching” fragments together using oligos）
   
2. 单次反应可组装的片段数量
   

参考文献

• New England Biolabs (NEB) 提供多种DNA组装试剂盒及预混液，包括 NEBuilder HiFi 和 Gibson Assembly，同时也提供 ET SSB。NEB还提供引物设计工具等资源。Gibson Assembly® 技术由 TelesisBio 授权 NEB 销售。
• Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343–345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318
• Gibson DG, Smith HO, Hutchison CA, Venter JC, Merryman C. (2010). Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods, 7(11), 901–903. https://doi.org/10.1038/nmeth.1515
• Rabe BA, Cepko C. (2020). A Simple Enhancement for Gibson Isothermal Assembly. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2020.06.14.150979

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更新日期：2026-02-27

编制人：磊子

审稿人：小藻