分子实验笔记12：基于PCR的质粒克隆（Plasmid Cloning by PCR）

背景（Background）

基于PCR的克隆（PCR-based cloning）具有极高的灵活性，几乎可将任意DNA片段插入所选的载体骨架（backbone vector）中，限制极少。

其基本原理是：在扩增目标DNA片段的同时，在其两端引入限制性酶切位点（restriction sites），以便后续将其高效克隆至目标质粒中。

本示例将演示，如何将一个cDNA从原始载体，转移至更适合功能研究的新载体。

如下图所示，我们将在目标基因（Your Gene of Interest, YGOI）两端分别添加EcoRI和NotI酶切位点，以便将其连接至受体质粒（recipient plasmid）。

图1：载体构建示例

PCR克隆引物设计（Designing Primers for PCR Based Cloning）

用于分子克隆的PCR引物通常包含以下三部分：

• 前导序列（Leader Sequence）：位于引物5'端的额外碱基（通常3–6 bp），有助于提高限制酶切割效率；
• 限制性酶切位点（Restriction Site）：所选的克隆用酶切位点（通常6–8 bp）；
• 杂交序列（Hybridization Sequence）：与目标序列互补结合的区域（通常18–21 bp）。

选择限制酶时，应使用DNA分析工具（如Addgene Sequence Analyzer）确认目标序列中是否存在该酶切位点。理想情况下，所选酶应满足：

• 在插入片段（insert）内部无切割位点；
• 在受体质粒的多克隆位点（Multiple Cloning Site, MCS）中有且仅有该位点；
• 加分项：两种能在同一种缓冲液（same buffer）中高效工作的酶更便于双酶切操作。

本例中，我们将使用EcoRI和NotI将cDNA插入受体质粒。为确保插入方向正确，需根据MCS结构，将上游酶切位点（EcoRI）置于正向引物（forward primer）5'端，下游酶切位点（NotI）置于反向引物（reverse primer）5'端。

接下来，需分析待扩增的DNA序列并设计特异性引物。下图展示了开放阅读框（ORF）两端序列及其在引物设计中的应用：

图2：引物设计

由于克隆的是完整ORF，我们需从起始密码子（ATG）扩增至终止密码子（本例为TGA）。若以质粒DNA为模板（而非基因组DNA或cDNA文库），18–21 bp的杂交序列通常足以保证特异性和PCR效率。

因此，正向引物的杂交序列为：
5'-ATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'

在其5'端添加EcoRI位点（GAATTC），得到：
5'-GAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'

需注意：许多限制酶在DNA线性末端切割效率较低（详见NEB说明）。因此，建议在酶切位点上游额外添加3–6个碱基以提升切割效率。这些碱基可任意选择，但应避免形成引物内部发夹结构（hairpin）。本例中添加TAAGCA，最终正向引物序列为：
5'-TAAGCAGAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'

反向引物设计类似，但需使用目标序列的反向互补链（reverse complement）以实现PCR扩增。我们取ORF末端18 bp（含终止密码子）：
5'-TGGCATATCTCGAAGTACTGA-3'

依次添加NotI位点（GCGGCCGC）和前导序列TAAGCA，得：
5'-TGGCATATCTCGAAGTACTGAGCGGCCGCTAAGCA-3'

再对其取反向互补（可使用在线工具，如SMS Reverse Complement），最终反向引物序列为：
5'-TGCTTAGCGGCCGCTCAGTACTTCGAGATATGCCA-3'

实验流程（Experimental Procedure）

图3：试验流程

1. 进行PCR并纯化产物

• 使用高保真Taq DNA聚合酶（high-fidelity Taq polymerase）扩增插入片段，以最大限度减少突变。产物越长，对聚合酶保真度要求越高。
• 退火温度应基于引物中杂交序列部分（即结合ORF的18–21 bp）的熔解温度（Tm）设定，而非整个引物的Tm。
• 若模板为质粒或简单DNA，非特异性扩增风险低，退火温度范围可较宽；若从基因组DNA、cDNA文库或通过RT-PCR扩增，则需延长引物、提高Tm以增强特异性。
• 使用试剂盒（如QIAquick PCR Purification Kit）纯化PCR产物，所得DNA即可用于后续酶切。

2. 酶切DNA

• 分别对PCR产物和受体质粒进行限制性酶切。由于后续凝胶纯化会损失DNA，建议使用全部PCR产物及1 μg受体质粒。
• 为确保受体质粒被双酶完全切割，酶切反应应至少进行4小时，过夜更佳。
• 重要提示：若仅使用单酶切，或所用酶产生兼容黏性末端/平末端，则必须使用磷酸酶（phosphatase）处理线性化载体，防止其自连。常用酶包括小牛碱性磷酸酶（CIP）或虾碱性磷酸酶（SAP），处理可在连接前或凝胶纯化前进行，具体依所选磷酸酶说明书而定。

3. 凝胶纯化插入片段与载体

• 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目标条带。为获得清晰、分离良好的条带，建议：
• 除DNA Marker外，建议同时点样未酶切的载体作为对照，便于排查酶切异常。
• PCR克隆中，电泳验证尤为关键——可确认PCR产物大小是否正确、条带强度是否足够（反映扩增效率与DNA得量）。
• 切胶纯化后，务必测定回收DNA的浓度。

4. 将插入片段连接至载体

• 标准连接反应总DNA量建议约100 ng。理想摩尔比为载体:插入片段 = 1:3。因两者长度不同，仅凭浓度难以精确计算，建议对每个构建设置两组不同比例的连接反应以优化条件。
• 必须设置阴性对照：例如，仅连接受体质粒（不加插入片段），用于评估载体自连或未切尽产生的背景克隆数量。

5. 转化（Transformation）

• 按感受态细胞说明书进行转化。常规克隆中，可将1–2 μL连接产物转化至DH5α或TOP10等化学感受态细胞。
• 若总DNA量极低（<1 ng）或难以获得菌落，建议使用高转化效率感受态细胞；若最终质粒较大（>10 kb），推荐使用电转化感受态细胞（electro-competent cells）。
• 转化后菌落数是初步判断实验成败的关键：“载体+插入片段”平板的菌落数应显著高于“仅载体”对照平板。后者反映背景水平——即非正确重组子的预期数量。
• 若“仅载体”对照菌落过多，可增设两组对照：一组加连接酶，一组不加。若不加连接酶仍有菌落，说明存在未切尽的环状空载体；若仅加连接酶组有大量菌落，则为载体自连所致。
• 若无任何菌落，应进行阳性对照（如转化已知质粒）验证感受态细胞活性，并尝试调整载体与插入片段的比例。

6. 获取重组质粒

• 挑取单菌落（根据对照平板背景高低，通常挑3–10个），接种过夜培养用于质粒提取。
• 取100–300 ng纯化质粒，用克隆所用的限制酶进行诊断性酶切（diagnostic digest），电泳检测。正确克隆应显示两条带：一条为载体大小，另一条为插入片段大小。

7. 测序验证（Verify your Plasmid by Sequencing）

基于PCR的克隆比传统酶切克隆具有更高的突变风险。PCR扩增的错误率因聚合酶而异，范围约为每500 bp至每1000万 bp出现1个错误。因此，无论使用何种高保真聚合酶，最终构建的质粒都必须进行测序验证。

参考文献

https://www.addgene.org/

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更新日期：2026-03-23

编制人：磊子

审稿人：小藻