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分子实验笔记11：无试剂盒法提取RNA（RNA Extraction Without a Kit）

来源：武汉市灰藻生物科技有限公司　　 浏览量：26　　 发布时间：2026-03-16 22:07:45

引言（Introduction）

本方案描述了一种无需商业试剂盒从组织或细胞中提取RNA的方法。

本步骤包括：细胞/组织匀浆与裂解（homogenization/lysis）。

本方案提供两种裂解体系选择：一是使用Solution D（配方见试剂部分），二是使用一体化的酸性硫氰酸胍-苯酚溶液（如TRIzol®）。在沉淀步骤中，亦提供两种选项：异丙醇（Isopropanol）或氯化锂（Lithium Chloride）。

图1：RNA 提取的不同步骤示意图

图1：RNA 提取的不同步骤示意图

开始前须知（Before Starting）

  • RNA不如DNA稳定，易受热、RNase（核糖核酸酶）及其他酶降解。

专业提示（Pro-Tips）：

  • 操作全程务必佩戴手套；
  • 尽可能将RNA样品和试剂保持低温，并快速操作，以减少降解；
  • 确保工作区域、设备及试剂无RNase污染——可使用RNase去污剂（如RNaseZap®或RNase AWAY®）处理台面与器具。

设备（Equipment）

  • 冷冻微量离心机（Refrigerated microcentrifuge）
    注：若仅有常温离心机，请参阅任一方案第4步说明。
  • 组织匀浆器（Homogenizer）
  • 涡旋振荡器（Vortexer）
  • –20°C 冰箱
  • –80°C 超低温冰箱

试剂（Reagents）

  • Solution D（用于方案选项#1）：
  • TRIzol® 或类似产品（如 TRI Reagent®、RNAzol®、QIAzol®）（用于方案选项#2）
  • 水饱和苯酚（Water-saturated Phenol）
  • 2 M 醋酸钠（Sodium Acetate），pH 4.0
  • 氯仿/异戊醇（Chloroform/Isoamyl alcohol, 49:1）
  • 75% 乙醇（Ethanol）
  • 无RNase水（RNase-free water）或TE缓冲液
  • 无RNase耗材：微量离心管、4 mL聚丙烯管
  • RNase去污剂（如 RNase AWAY® 或 RNaseZAP®）
  • 异丙醇（Isopropanol）（用于沉淀步骤A）
  • 7.5 M 氯化锂（Lithium Chloride）（用于沉淀步骤B）
  • 糖原（Glycogen）（可选，作为沉淀载体）

⚠️ 安全警示（Caution）：
请务必查阅上述试剂的安全数据表（SDS），了解其危害信息。操作挥发性试剂（如苯酚、氯仿）时，应在通风橱（fume hood）内进行，并确保实验室通风良好。

操作流程（Procedure）

选项#1：Solution D 法

开始前请先配制 Solution D（配方见上文）。若使用 TRIzol®，请直接跳至“选项#2：TRIzol® 法”。

  1. 在 Solution D 中匀浆或裂解组织/细胞：
  2. 室温静置5分钟，使核蛋白复合物充分解离。
    注：RNA提取效率高度依赖裂解效果。哺乳动物组织通常经简单匀浆即可；但骨组织、细菌、酵母或植物样本因细胞壁坚韧，需额外处理（如液氮研磨、酶解等）以实现有效裂解。
  3. 从匀浆液中提取RNA：
    将1 mL裂解液转移至4 mL离心管，依次加入以下试剂并混匀：
  4. 冰上孵育15分钟，随后于4°C、12,000 × g离心15分钟，分离RNA相。
  5. 用移液器小心吸取上层水相（aqueous phase）至新的无RNase管中。
    注意：混合液分为三层——下层有机相、中间界面相（interphase）、上层水相。务必避免吸入界面相（含DNA和蛋白质）。
  6. 沉淀RNA（二选一）：
  7. 4°C、10,000 × g离心20分钟，弃上清。管底应可见白色胶状总RNA沉淀。
  8. 洗涤RNA：用0.5–1 mL 75%乙醇重悬沉淀，涡旋数秒，4°C、10,000 × g离心5分钟，弃上清。
  9. 尽量吸净乙醇，室温晾干沉淀5–10分钟。
  10. 用无RNase水或TE缓冲液重悬RNA沉淀。
    通过分光光度计（如Nanodrop）、琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪（Bioanalyzer）定量并评估RNA质量。RNA应于    –80°C保存，避免反复冻融。

选项#2：TRIzol® 法

  1. 在TRIzol®中匀浆或裂解组织/细胞：
  2. 室温静置5分钟，使核蛋白复合物解离。（注：裂解效率要求同上）
  3. 提取RNA：
    每1 mL TRIzol®加入0.2 mL 氯仿/异戊醇（49:1），剧烈手摇10秒。
  4. 冰上孵育2–3分钟，4°C、12,000 × g离心15分钟分离RNA相。
  5. 吸取上层水相至新管。
    注意：TRIzol®体系中，下层有机相呈红粉色。务必避免吸入中间界面相。
  6. 沉淀RNA（同方案#1第6步）：
  7. 4°C、10,000 × g离心20分钟，弃上清。管底应有白色胶状RNA沉淀。
  8. 用0.5–1 mL 75%乙醇重悬沉淀，涡旋数秒，4°C、10,000 × g离心5分钟，弃上清。
  9. 吸净乙醇，室温晾干5–10分钟。
  10. 用无RNase水或TE重悬RNA。
    通过Nanodrop、琼脂糖凝胶或Bioanalyzer评估浓度与完整性。样品应保存于    –80°C，避免反复冻融。

参考文献

https://www.addgene.org/

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— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

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更新日期：2026-02-27

编制人：磊子

审稿人：小藻