分子实验笔记10：质粒DNA的限制性酶切（Restriction Digest of Plasmid DNA）

引言（Introduction）

限制性内切酶消化（Restriction enzyme digestion）利用自然界存在的限制性内切酶（restriction enzymes），在DNA特定序列处进行切割。

目前已发现数百种不同的限制酶，使科研人员能够靶向多种识别位点。常用限制酶列表可参见NEB官网（新窗口打开）。

该技术广泛应用于分子克隆，如PCR克隆或限制性酶切克隆（restriction cloning），也常用于通过诊断性酶切（diagnostic digest）快速验证质粒身份。

设备（Equipment）

• 电泳槽（Electrophoresis chamber）
• 移液器（Pipetman）

试剂（Reagents）

• 目标质粒的液态DNA样品（推荐用量见下文）
• 合适的限制性内切酶（用量请参照厂商说明书）
• 匹配的限制酶缓冲液（Restriction digest buffer，参照厂商说明）
• 上样染料（Gel loading dye）
• 电泳缓冲液（Electrophoresis buffer）
• 移液枪头（Pipet tips）

操作步骤（Procedure）

1. 选择用于酶切质粒的限制酶。
   
2. 根据所选酶确定合适的反应缓冲液。
   
3. 在1.5 mL离心管中配制反应体系：
4. 轻柔吹打混匀。
5. 于适宜温度（通常37°C）孵育1小时。务必遵循厂商说明。
   
6. 通过琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。

图1：选择限制性内切酶酶切质粒

技巧与常见问题（Tips and FAQ）

• 限制酶必须在取出–20°C冰箱后立即置于冰盒中！高温会导致酶变性失活。
• 若难以找到仅切割载体多克隆位点（MCS）而不切插入片段（insert）的单一酶，可尝试使用产生兼容黏性末端（compatible sticky ends）的两种不同酶。参见NEB兼容末端表。
• 若无法获得兼容黏性末端，则需将突出端补平，进行平末端连接（blunt end ligation）： • 3′突出端去除或5′突出端补平可使用T4 DNA聚合酶（T4 DNA Polymerase）或Klenow大片段（Klenow Fragment）。
• 若使用平末端或单酶切载体进行克隆，为防止载体自连，需用磷酸酶（phosphatase）处理： • 常用小牛碱性磷酸酶（CIP, calf alkaline phosphatase）或虾碱性磷酸酶（SAP, shrimp alkaline phosphatase）；
  • 操作请严格遵循厂商说明。
• 若酶切失败，请检查该酶是否对甲基化敏感（methylation sensitive）。在Dam⁺或Dcm⁺大肠杆菌菌株中扩增的质粒，其特定酶切位点可能因甲基化而抗切割。详见NEB甲基化敏感酶列表。
• 某些情况下，酶可能切割与识别序列相似但不完全相同的位点，称为“星号活性”（Star Activity）。诱因包括甘油浓度过高等。详情参见NEB星号活性说明。
• 若需对多个质粒进行相同酶切（如批量诊断），可配制主混合液（Master Mix）——包含除DNA外的所有组分。将各质粒DNA分装至不同管中，再分别加入等量主混。此法节省时间并提高反应一致性。

图2：双酶切后产生的粘性末端

参考文献

https://www.addgene.org/

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更新日期：2026-02-27

编制人：磊子

审稿人：小藻