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分子实验笔记09：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）和测序验证

来源：武汉市灰藻生物科技有限公司　　 浏览量：31　　 发布时间：2026-03-10 21:03:05

引言（Introduction）

标准PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种体外（in vitro）扩增技术，可利用Taq DNA聚合酶（Taq Polymerase）对DNA分子中某一特定短片段（例如单个基因）进行指数级复制。

仅需一份DNA模板（template），研究者即可通过一套简单的试剂和反复的加热-冷却循环（即变性与退火），获得数千份完全相同的拷贝。

该技术的自动化得益于从嗜热菌Thermus aquaticus中分离出的耐热DNA聚合酶——Taq酶。Taq酶能耐受多次高温变性循环，而其他来源的DNA聚合酶在此条件下会失活。

除模板DNA和Taq聚合酶外，PCR反应还需以下组分：

  • 脱氧核苷三磷酸（dNTPs）：包括腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），以等摩尔比例提供DNA合成原料；
  • 两条特异性单链DNA引物（oligonucleotide primers）：分别与目标片段上游（5′端）和下游（3′端）互补结合。

当上述组分在合适缓冲液中混合后，通过一系列变性（denaturation）步骤，Taq聚合酶即可在引物之间合成新的DNA链。

经过多轮循环，仅需几纳克（ng）模板DNA，即可产出数微克（μg）的目标DNA产物。

PCR完成后，可通过琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）根据片段大小验证扩增结果。

基础PCR程序（Basic PCR Program）

  1. 初始变性（Initial Denaturation）：94°C，2分钟
    使双链DNA模板充分解链，破坏碱基对间的氢键。此步通常在94–98°C进行。
  2. 变性（Denature）：94°C，30秒
    持续维持双链DNA解离状态。
  3. 退火（Anneal primers）：55°C，30秒
    正向与反向引物在此温度下稳定结合至单链DNA模板两端；同时，Taq聚合酶亦可稳定结合至引物-DNA复合物。
  4. 延伸（Extend DNA）：72°C，1分钟
    Taq聚合酶的最适活性温度为70–75°C，此步骤使其高效、准确地合成新链。
  5. 重复步骤2–4共25–30个循环。
  6. 最终延伸（Final Extension）：72°C，5分钟
    补平新合成DNA链的突出末端，确保产物完整性。

材料清单（Materials List）

每50 μL PCR反应所需试剂：

  • 薄壁PCR管（Thin-walled PCR tube）
  • 冰盒（Ice Bucket）
  • 模板DNA（Template DNA）：2 μL（10–500 ng）
  • 10× Taq缓冲液（含MgCl₂）：5 μL
  • dNTP混合液（各10 mM）：1 μL
  • 正向引物（Forward Primer，10 μM母液）：2.5 μL
  • 反向引物（Reverse Primer，10 μM母液）：2.5 μL
  • 无菌去离子水（Sterile dH₂O）：36.8 μL（可调）
  • Taq DNA聚合酶（5 U/μL）：0.2 μL
  • PCR仪（PCR Machine）
  • 琼脂糖凝胶（Agarose Gel）

操作流程（Procedure）

引物设计与PCR（Primer Design and PCR）

  1. 设计引物。参见我们的引物设计protocol。
    注： 是一款优秀的引物设计工具。
  2. 将薄壁PCR管置于冰上。
  3. 配制50 μL反应体系（所有试剂保持在冰上）：
  4. 将反应管放入PCR仪。
  5. 将退火温度设为引物熔解温度（Tm）低5°C。
  6. 延伸时间按产物长度设定：普通Taq酶为每kb 1–2分钟；若使用具校对功能（proofreading）的高保真酶，请参考厂商说明。
  7. 运行以下程序：
  8. 取2 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，验证片段大小与产量。

PCR扩增流程示意图

图1：PCR扩增流程示意图

主混合液配制（Master Mix Preparation）

  1. 将每种试剂体积乘以反应数，并额外增加10%以补偿移液误差。例如：7个不同引物对 → ×7。
  2. 在1.5 mL离心管中混合以下组分：
  3. 轻柔吹打混匀，全程保持在冰上。
  4. 先向各PCR管中分别加入正、反向引物（各2.5 μL）。
    技巧：将正向引物加在一侧管壁，反向引物加在另一侧，便于确认已加。
  5. 向每管加入45 μL主混合液（50 μL总体系 – 2.5 μL正向引物 – 2.5 μL反向引物）。
  6. 盖紧管盖，轻弹管底使液体汇集，再放入PCR仪。

引物稀释（Diluting Primers）

多数引物由公司合成并以冻干粉形式提供。使用者需用无菌dH₂O重悬。

  • 配制100 μM母液：加入的dH₂O体积（μL）= 引物nmol数 × 10。
    例：38.5 nmol引物 → 加385 μL水。
  • 立即配制10 μM工作液：取100 μL 100 μM母液 + 900 μL dH₂O（1:10稀释）。

技巧与常见问题（Tips and FAQ）

技巧（Tips）

  • 若目标序列GC含量高，可适当延长变性时间。
  • 正、反向引物的熔解温度（Tm）应尽量接近。退火温度设为Tm – 5°C；若出现非特异性条带，可逐步提高退火温度1–2°C。
  • DNA合成速率约为1–2 kb/分钟，延伸时间应根据目标片段长度调整。

如何设计引物？
请参阅我们的引物设计指南。如用于克隆，请参考“基于PCR的质粒克隆”实验流程。

PCR失败怎么办？
尝试在每管中加入： - 1 μL 25 mM MgCl₂（补充缓冲液中可能因冻融损失的Mg²⁺）； - 和/或 1 μL DMSO（有助于GC-rich模板变性）。
建议设置三组对照：仅加MgCl₂、仅加DMSO、两者都加。

各组分作用详解：

  • 模板DNA（Template DNA）：
    含有待扩增的目标序列，必须与引物互补才能有效扩增。
  • Taq缓冲液（含MgCl₂）：
    为聚合酶提供最佳化学环境。Mg²⁺等二价阳离子可稳定反应体系；高浓度会提高聚合酶错配率，亦可用于PCR介导的定点突变。
  • dNTPs：
    DNA合成的基本单元，由聚合酶逐个添加至新生链。
  • 正向与反向引物：
    分别与模板DNA正义链和反义链3′端互补，作为DNA合成的起始点。
  • Taq DNA聚合酶：
    耐热型DNA聚合酶，最适温度约70°C，负责催化新链合成。
  • 无菌dH₂O：
    补足反应体积，提供适宜溶剂环境。


序列验证

序列验证（sequence verification），例如插入基因（gene/insert）、融合蛋白（fusion proteins）、点突变（point mutations）、缺失（deletions）等，需要选择一个或多个特异性寡核苷酸引物（oligonucleotide primers），这些引物应位于待验证区域的两侧（即“侧翼”）。

在选择测序引物时，需考虑以下因素：

  • 引物是否唯一？
    确保该引物在整个质粒构建体（construct）中仅有一个结合位点（anneals once）。
  • 引物与目标区域的距离是否合适？
    引物应距离目标区域    至少50个核苷酸（nt），最多不超过300个核苷酸。过近或过远都会影响测序质量。
  • 是否有商业化通用引物可用？
    许多常用引物（如M13F、M13R、T7、SP6等）已整合在常见质粒骨架（plasmid backbone）中。多数测序平台（sequencing core）会提供一份    免费通用引物列表，可直接选用而无需额外费用。

一次良好的测序反应通常可获得300–900个碱基对（bp）的高质量可用序列。您将收到一个测序峰图文件（trace file，格式为.ab1），

该文件以彩色峰图形式直观展示序列：每种颜色代表一种核苷酸碱基（A、T、C、G）。

下图展示了一段高质量测序反应的典型峰图示例：

高质量测序反应样本的测序结果文件示例

高质量测序反应样本的测序结果文件示例


需要注意的是，测序反应起始和末端区域的序列往往不可靠。尽管测序结果可能给出了具体碱基，但通过查看峰图（trace file）会发现这些碱基判读（base calls）可信度低。


下图展示了一段背景噪音高、信号混乱的测序峰图：


杂峰，信号差

杂峰，信号差

我可以用什么软件查看 .ab1 峰图文件？
有多款免费软件支持打开 .ab1 文件，例如：

  • 4Peaks（Mac）
  • SnapGene Viewer（Mac/PC）
  • FinchTV（Mac/PC）
  • Sequence Scanner（PC）
  • Chromas（PC）


如何判断某个碱基峰是否被错误判读？
打开 .ab1 峰图文件，使用软件中的搜索功能定位到可疑序列位置，仔细观察该区域的峰形。可靠的碱基应表现为单一、清晰、高度适中且无重叠的峰。

例如，在下方峰图中，70号碱基之后出现了同一位置的多重峰（multiple peaks），表明此处可能存在杂合、插入或测序错误。仅看碱基序列文本容易误判，而峰图能提供更真实的信息。

重叠峰

重叠峰

我的序列中出现了“N”，这是什么意思？
“N”是IUPAC标准中表示任意碱基（any of the four bases: A/T/C/G）的符号，通常意味着测序软件无法确定该位置的确切碱基。此时应：

  • 打开 .ab1 峰图文件，手动检查该位置的信号；
  • 若峰形单一清晰，可自行判读正确碱基；
  • 若峰形模糊或重叠，“N”可能是由测序反应中的错误插入、模板不纯或信号衰减导致。

参考文献

https://www.addgene.org/

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更新日期：2026-02-09

编制人：磊子

审稿人：小藻