分子实验笔记08：琼脂表面加抗生素法（Over-Agar Antibiotic Plating）

引言（Introduction）

本方案描述了一种在已凝固的LB琼脂平板表面添加抗生素的方法，用于筛选转化成功的大肠杆菌（E. coli）。

该“琼脂表面加药”（over-agar plating）技术的优势在于：研究者无需为不同抗性基因的质粒，分别配制含抗生素的琼脂平板，即可在同一基础平板上，灵活筛选携带不同抗性标记的转化子。

本方案以羧苄青霉素（carbenicillin）为例进行说明，但该方法可推广至其他抗生素——只需通过预实验绘制选择曲线（selection curve），确定最佳工作浓度即可。

设备（Equipment）

• 用于移液和涂布的枪头（Pipette tips for both pipetting and spreading）
• 本生灯或其他小型火焰源（Bunsen burner or other small flame source）
• 恒温培养箱（Incubator）

试剂（Reagents）

• 不含抗生素的6 cm直径LB/琼脂平板（6 cm diameter LB/agar plates without antibiotic）
• 高浓度（100 mg/mL，即1000×）羧苄青霉素母液（溶于无菌水；也可替换为其他抗生素）
• 已转化含羧苄青霉素（或相应抗生素抗性基因）的E. coli菌株

操作步骤（Procedure）

第一天（Day 1）

1. 将羧苄青霉素用LB液体培养基稀释至1–4 mg/mL的工作浓度。

• 该浓度范围是通过经验确定的，可实现有效的表面选择（参见下方选择曲线）。
• 此处选用羧苄青霉素（carbenicillin）而非氨苄青霉素（ampicillin），因其化学性质更稳定，能更有效地抑制非转化菌生长（例如显著减少“卫星菌落” satellite colonies 的出现），尽管成本更高。
• 2. 在已凝固的6 cm LB-琼脂平板上，加入150 µL上述羧苄青霉素溶液，并轻柔涂布至整个表面，直至液体基本被吸收（表面仅残留极少量可见液滴）。
• 我们通常直接使用移液枪头进行涂布：将枪头轻轻弯折成“L”形，即可作为简易涂布棒。也可使用其他适配培养皿尺寸的无菌涂布工具。
• 3. 盖上皿盖，在室温下静置至少30分钟，使抗生素充分渗入琼脂表层。
• 4. 在此期间，通过热激法（heat shock）将目标质粒转化入DH5α E. coli感受态细胞。
• 5. 取50 µL转化后的菌液（含复苏培养基），滴加至已加抗生素的平板上，并轻柔涂布至液体基本吸收。
• 涂布方式同上，可使用弯折的枪头或其他适配的涂布器。
• 6. 将平板倒置于37°C培养箱中，培养18小时。

第二天（Day 2）

7. 观察菌落形成情况。
以下展示了优化羧苄青霉素浓度用于E. coli转化子筛选的实验结果。

示例数据（Sample Data）

在LB-琼脂平板上，通过琼脂表面添加不同浓度羧苄青霉素筛选转化E. coli的结果：

图1：不含羧苄青霉素的对照组平板

• 对照组（无羧苄青霉素）：
  平板呈菌苔（lawn），无选择效果。

图2：将 150 µL 浓度为 0.1 mg/mL 的羧苄青霉素溶液涂布于琼脂平板上

• 150 µL 0.1 mg/mL 羧苄青霉素：
  仍呈菌苔，未见明显选择作用。

图3：将 150 µL 浓度为 1 mg/mL 的羧苄青霉素溶液涂布于琼脂平板上

• 150 µL 1 mg/mL 羧苄青霉素：
  出现多个清晰、分离的单菌落，选择效果良好。

图4：将 150 µL 浓度为 2 mg/mL 的羧苄青霉素溶液涂布于琼脂平板上

• 150 µL 2 mg/mL 羧苄青霉素：
  菌落数量少于1 mg/mL组，但仍为有效选择。

图5：将 150 µL 浓度为 4 mg/mL 的羧苄青霉素溶液涂布于琼脂平板上

• 150 µL 4 mg/mL 羧苄青霉素：
  菌落数量与1–2 mg/mL组相当，但菌落尺寸明显更小，表明高浓度可能轻微抑制细菌生长，但仍具备有效选择能力。
• 
• 图6：转化大肠杆菌经羧苄青霉素琼脂平板铺板后的选择曲线图：羧苄青霉素琼脂表面加药后转化E. coli的选择曲线。图中所示为每板加入150 µL不同浓度母液的结果。

注：我们发现该方法对多种抗生素浓度具有较宽的耐受范围，上述结果仅代表单次实验。若用于发表数据，需重复实验以评估变异性。

参考文献

https://www.addgene.org/

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更新日期：2026-02-28

编制人：磊子

审稿人：小藻