菌株（冻干粉/甘油菌/斜面/平板/菌液）到手后的处理方法

对于菌株保藏，有两种保藏方法应用地较为广泛。第一种，将菌悬液和甘油混合装入冻存管，制备为甘油菌形式，置于-80℃冰箱长期保存；第二种，将菌株和保护剂（如脱脂牛奶）混合分装到安瓿瓶或冻干管，利用真空冻干机除去水分，真空融封保存。甘油菌和冻干粉是保存微生物的有效手段，对于科研人员来说，也是市面上最常见的菌株保藏形式，无需很长等待时间。甘油菌和冻干粉长期保存，菌株处于非活跃的休眠状态，但仍保留着较高存活率和潜在活性，需置于合适培养条件下复壮复活。根据菌株特性，可将甘油菌和冻干粉复苏活化，并制作为琼脂斜面、平板或菌液形式，这些活化形式的菌株已恢复高活性，其转接难度低，使用方便，缺点是不能长期存放。

冻干粉打管说明

操作步骤

1、产品说明

冻干管

2、用75%酒精棉擦拭冻干管表面进行消毒，将管顶端于酒精灯外焰上均匀加热。

酒精灯

3、立即滴2~3滴无菌水于加热部位，使管壁破裂。

冻干粉打管说明

4、用镊子或其它适宜工具敲下破裂处。

冻干粉打管说明

5、用无菌吸管吸取0.5ml左右液体培养基（《菌种说明书》中固体培养基去掉琼脂即可）或无菌水，将冻干管中将冻干菌粉全部溶解。

冻干粉打管说明

6、将溶解后的菌悬液转移至盛有4~5mL液体培养基的试管中混匀，可将残留在吸管中的1-2滴菌悬液转接至固体培养基上。

7、将液体试管和斜面试管于推荐条件下静置培养，以液体培养结果为准。

注意事项

1、打管操作需由专业微生物技术人员在相应防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作。打管时冻干管应远离面部，并适当保护眼睛。

2、打管操作应在烧杯或托盘上方进行，用完的冻干管应高压灭菌处理后丢弃。

3、冻干管打开后需一次用完，不能留存。

4、菌种经过冻干保藏后，处于休眠状态，一代菌种需适当延长培养时间，转接至2-3代恢复活力。

斜面接种说明

细菌操作步骤

1、产品说明；

菌株斜面

2、根据要求准备两块新鲜平板，一支液体试管；

3、打开试管，将试管口边缘灼烧一圈；用接种环挑取1-2环菌体，在新鲜平板上进行划线；

4、再次挑取1-2环菌体，以研磨的方式接种到液体试管中；

菌株斜面接种

5、将接种后的平板和液体试管按照要求置于培养箱培养。

霉菌操作步骤

1、根据要求准备两块新鲜平板；

2、试管斜面表面消毒后，在安全柜中打开；

3、用无菌接种锄和接种铲切0.5×0.5cm²的小正方形块；

菌株斜面接种

4、取两小正方形块分别平放至两个平板中心琼脂表面上，做好菌株培养信息记录，霉菌切块完成后用具要立即消毒；

菌株斜面接种

5、将平板按照说明书要求，放入培养箱中培养，禁止封口膜密封，平板基本长满即可使用。

注意事项

1、接种铲、接种锄确保冷却后操作；

2、试管塞必须使用硅胶塞或棉塞，确保透气；

3、接种完的原试管种，用保鲜膜密封，4℃保藏期一个月，期间无污染可继续使用。

平板接种说明

细菌操作步骤

1、产品说明

菌株平板接种

2、在无菌环境下，用无菌接种环挑取平板菌落1-2环；

菌株平板接种

3、转接到新的固体或液体培养基中，做好菌株培养信息记录，然后转移至培养箱，按要求培养即可；

菌株平板接种

或者

菌株平板接种

霉菌操作步骤

1、准备新鲜平板两个，接种铲、接种锄各一个；

2、用红外加热仪灼烧接种铲和接种锄，冷却备用；

霉菌平板接种

3、霉菌平板外壁消毒后，在无菌环境下打开，先用接种锄，再用接种铲切块；

霉菌平板接种

4、接种铲将菌块挑起，放至平板琼脂表面上，盖好平板，霉菌切块完成后用具要立即消毒；

霉菌平板接种

5、将平板按照说明书要求，置于霉菌培养箱中培养，禁止封口膜密封，平板基本长满即可使用。

注意事项

1、平板菌株已经活化好，可直接使用；

2、长时间存放，会导致活力下降，需转接活化一次再使用；

3、请在5代以内使用，5代后建议销毁；

4、菌株收到后应当在有效期内使用。

菌液接种说明

操作步骤

1、产品说明；

菌株菌液

2、根据要求准备两块新鲜平板，液体试管一支；

3、将菌液轻微混匀，吸取少量菌液，按照3%~5%的接种量接种到液体试管中，做好菌株培养的信息记录；

菌液转接说明

4、将吸取的菌液滴加到两块新鲜平板上，均匀涂抹，做好菌株培养的信息记录；

菌液转接说明

5、将平板和液体试管按照要求，置于培养箱中培养。

注意事项

1、本菌株已经活化好，可直接使用。若暂不使用，应按上述条件要求进行保存；

2、长时间存放，会导致活力下降，需转接活化一次再使用；

3、请在5代以内使用，5代后建议销毁；

4、菌株收到后应当在有效期内使用。

甘油菌使用说明

甘油菌接种说明

1、产品说明；

甘油菌

2、从-80℃冰箱中取出甘油菌种，放置在水浴中快速融化并适当摇动，直至管内甘油菌液全部溶解；

3、无菌操作下打开甘油管，吸取菌液滴加到两块新鲜平板上，均匀涂抹，做好菌株培养的信息记录；

甘油菌转接

4、将平板按照说明书要求，放入培养箱中培养。

制备方法

1、配置10%-30%的甘油溶液，121℃灭菌30min后备用；

2、准备新鲜斜面或平板，无菌滴管吸取甘油溶液，将菌体或孢体洗脱下来，形成菌悬液，洗脱过程可以用涂布棒缓慢刮取，收集更高浓度的菌悬液；

3、如果是菌液形式，可将菌液离心去上清（离心不是必须操作，是为了提高菌体纯度），混入甘油溶液制为菌悬液（根据菌液体积，可适当提高甘油溶液浓度）；

4、吸取菌悬液分装到冻存管，先置于程序降温盒，再置于-80℃冰箱冻存；

注意事项

1、一支甘油菌种，接种2个斜面或1个平板，转接过多易复苏失败；

2、将冻存菌株取出（转移过程需要使用干冰盒，如果是存放在液氮气相中应注意防护），准备水浴溶解，切勿常温融化；

3、将菌株迅速置于水浴融化，细菌40℃，真菌30℃，约2min全部溶解后接种到适宜培养基（不需要离心弃甘油上清，可以直接带甘油液体活化）；

4、甘油菌打开后一次性用完，避免反复冻融；

5、请在5代以内使用，5代后建议销毁。

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— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

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2024.05.20