分子实验笔记07：质粒转入菌体后，固体培养筛选的一般流程
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：27 发布时间：2026-01-18 14:47:40
引言（Introduction）
质粒（plasmids）可携带一个或多个抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes），赋予携带该质粒的细菌对特定抗生素的抗性。利用这一特性，研究人员可通过人工选择（artificial selection）——即在含抗生素的培养基中培养细菌——轻松地从不含质粒的细菌中筛选出含有目标质粒的菌株。
Luria肉汤（Luria broth, LB）是一种营养丰富的培养基，广泛用于实验室细菌培养。向LB中加入琼脂（agar）后，会形成凝胶状固体培养基：细菌虽无法消化琼脂，但可从中摄取LB提供的营养物质。若在此凝胶中添加抗生素，则仅允许携带相应抗性基因（通常由质粒提供）的细菌生长，从而实现高效筛选。以下操作流程将指导您自行配制含所需抗生素的LB/琼脂平板。
设备（Equipment）
- 高压灭菌锅（Autoclave）
- 水浴锅（Water bath）
- 移液器（Pipettor）
试剂（Reagents）
- 预混LB-琼脂粉 37 g/L，成分包括：
- 1 L 无菌水（Sterile H₂O）
- 所需规格的无菌培养皿（Sterile plates）——我们通常使用 60 mm × 15 mm 培养皿，可容纳 5–10 mL 琼脂，最多可清晰分辨约100个单菌落。
专业提示（Pro-Tip）：若需筛选大量菌落，建议使用更大规格的培养皿。许多实验室采用 100 mm × 15 mm 培养皿，可容纳 10–25 mL 琼脂。
- 可高压灭菌的锥形瓶（Autoclavable flasks）
- 无菌移液管（Sterile pipettes）
- 盛放抗生素的冰盒（Ice bucket to hold antibiotic）
- 1000× 抗生素母液（Antibiotic at 1000× concentration），溶于合适的溶剂（参见下方表格）
抗生素浓度推荐表（Antibiotic Concentrations）
| 抗生素（Antibiotic） | 推荐母液浓度（Recommended Stock Concentration） | 推荐工作浓度（Recommended Working Concentration） |
|---|---|---|
| Ampicillin（氨苄青霉素） | 100 mg/mL | 100 µg/mL |
| Bleocin（博来霉素） | 5 mg/mL | 5 µg/mL |
| Carbenicillin*（羧苄青霉素） | 100 mg/mL | 100 µg/mL |
| Chloramphenicol（氯霉素） （溶于乙醇 EtOH） | 25 mg/mL | 25 µg/mL |
| Coumermycin（香豆霉素） （溶于DMSO） | 25 mg/mL | 25 µg/mL |
| Gentamycin（庆大霉素） | 10 mg/mL | 10 µg/mL |
| Kanamycin（卡那霉素） | 50 mg/mL | 50 µg/mL |
| Spectinomycin（壮观霉素） | 50 mg/mL | 50 µg/mL |
| Tetracycline（四环素） | 10 mg/mL | 10 µg/mL |
注：除非另有说明，抗生素粉末通常溶于去离子水（dH₂O）。
* 羧苄青霉素（Carbenicillin）可替代氨苄青霉素。其化学性质更稳定，能更有效地筛选含目标质粒的细菌（例如减少“卫星菌落” satellite colonies 的出现），但价格更高。
操作步骤（Procedure）
1. 按每升熔融琼脂称取37 g预混LB-琼脂粉。
实际称量质量取决于您计划倒制的平板数量。
示例：若需制备20块平板，每块最多加10 mL，则共需200 mL培养基。
为防止洒漏或计量误差，建议多配约10%（如220 mL）。
因此，220 mL LB-琼脂所需粉末量为：
(37 g/L) × 0.220 L = 8.14 g。
2. 将称好的LB-琼脂粉转移至合适体积的耐压瓶中用于高压灭菌。
例如：400 mL琼脂用1 L瓶，200 mL用500 mL瓶。预留足够空间以防灭菌时沸腾溢出。
3. 向瓶中加入对应体积的无菌水（本例为220 mL），轻轻旋摇形成均匀胶体。
4. 用瓶盖或铝箔 loosely 覆盖瓶口（切勿密封！），贴上高压灭菌指示胶带。
该胶带在121°C维持10分钟以上会变色。另用实验室胶带标注姓名、日期及内容物，避免遗忘在灭菌锅内造成混淆。
5. 将混合液放入高压灭菌锅，在20 psi下于121°C灭菌至少30分钟。
高压可防止高温下液体沸腾溢出。
专业提示：尽管此条件可杀灭大多数污染物，但某些芽孢（spores）可能存活。若处理特殊微生物，请查阅文献确认合适的灭菌方法。
6. 灭菌期间，准备倒板工作站：
- 选择带酒精灯的洁净实验台区域；
- 用70%乙醇喷洒台面并用纸巾擦拭；
- 清点所需数量的培养皿并堆叠放置；
- 在皿底标注日期、培养基类型及所用抗生素名称。
专业提示：我们使用彩色记号笔批量标记——不同颜色对应不同抗生素。
- 将酒精灯置于倒板区域一侧，留出空间放置熔融琼脂瓶、抗生素管架及操作区。
7. 配制抗生素母液。
在加入熔融琼脂前，需先配制1000×母液。
示例：若工作浓度为100 µg/mL氨苄青霉素，则母液浓度应为100 mg/mL（即100,000 µg/mL）。称取100 mg粉末溶于1 mL水，涡旋溶解后经滤膜除菌。
8. 准备60°C水浴，水量需能浸没琼脂瓶约75%高度。
专业提示：60°C是理想温度——琼脂仍为液态，而多数抗生素在此温度下稳定。请根据具体抗生素说明书确认。
9. 从高压灭菌锅中取出熔融琼脂。
专业提示：灭菌结束后，建议将锅门微开约10分钟，释放蒸汽并初步降温。取出时务必佩戴隔热手套！
10. 将琼脂瓶部分浸入60°C水浴中至少5分钟。
专业提示：切勿让水浴水接触瓶口（非无菌）。冷却后的琼脂应温热但不烫手——若戴普通实验手套无法直接拿取，则温度仍过高。建议使用激光测温枪确认温度。
11. 点燃酒精灯，采用无菌操作将抗生素母液加入约60°C的熔融琼脂中。
12. 轻柔旋摇琼脂瓶，确保抗生素均匀分布。
13. 在火焰旁逐个打开培养皿，开始倒板。
首块平板可用移液器量取目标体积（如5–10 mL），以熟悉该体积在皿中的覆盖效果。
14. 后续平板可直接从瓶中倾倒。
专业提示：
• 倒板后轻旋培养皿以消除气泡并使琼脂均匀铺平；
• 每倒完一块立即盖好并堆叠。
• 若倒板过程中琼脂在瓶中开始凝固，应停止操作并重新配制。若未加抗生素，可再次高压灭菌或微波加热复溶（注意防暴沸！）。
15. 将平板置于实验台静置凝固。
专业提示：室温下约30分钟凝固，但我们通常过夜晾干以减少冷凝水。干燥后装入含吸水材料的塑料袋，4°C保存备用。
16. 平板凝固干燥后，需进行抗生素功能验证：
- 取两块新制平板；
- 第一块划线接种已知抗性菌株；
- 第二块划线接种非抗性菌株；
- 于适宜温度过夜培养，观察生长情况（参见下方示例数据）。
示例数据（Sample Data）
以下结果中，“(–)”表示测试菌株不应具有抗性，“(+)”表示应具有抗性。
图1：阳性结果：只有抗性菌株生长
✅ 阳性结果：仅抗性菌株生长
若操作正确，应仅见抗性菌株生长。此时平板可用于实验或4°C保存。注意：平板保存不应超过1个月，使用前需检查是否污染。
图2：阴性结果 1：两种菌株均生长
❌ 阴性结果1：两种菌株均生长
若划线菌株正确，则可能原因：
- 抗生素已降解；
- 忘记添加抗生素；
- 抗生素浓度过低，无法有效筛选。
图3：阴性结果2：两种菌株均未生长
❌ 阴性结果2：两种菌株均不生长
可能原因：
- 使用了错误的抗生素；
- 抗生素浓度过高，抑制了所有菌株；
- 一种或两种菌株已失活。验证方法：将两株菌分别划线于不含抗生素的LB平板，确认其活性。
图4：阴性结果3：仅非抗性菌株生长
❌ 阴性结果3：仅非抗性菌株生长
极可能原因：使用了错误的抗生素，或混淆了菌株。
参考文献
https://www.addgene.org/
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更新日期：2026-01-18
编制人：磊子
审稿人：小藻