分子实验笔记06：质粒转入菌体后，液体培养（Liquid Culture）扩增的一般流程
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：78 发布时间：2026-03-16 22:00:35
引言（Introduction）
质粒（plasmids）通常携带一个或多个抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes），使携带该质粒的细菌对特定抗生素产生抗性。这一特性使研究人员能够通过人工选择（artificial selection）——即在含抗生素的培养基中培养细菌——轻松地从不含质粒的细菌中分离出含有目标质粒的菌株。
Luria肉汤（Luria broth, LB）是一种营养丰富的培养基，广泛用于实验室细菌培养。LB琼脂平板（LB agar plates）常用于分离携带特定质粒的单克隆菌落（clonal colonies）。然而，液体培养（liquid culture）能支持更高密度的细菌生长，适用于扩增足够数量的细菌，以提取足量质粒DNA用于后续实验。以下为接种LB液体过夜培养物的标准操作流程。
操作步骤（Protocol）
1. 配制液体LB培养基。
例如，配制400 mL LB，向500 mL玻璃瓶中加入：
- 4 g NaCl
- 4 g 胰蛋白胨（Tryptone）
- 2 g 酵母提取物（Yeast Extract）
- 加去离子水（dH₂O）至总体积400 mL
注：若实验室已有预混的LB琼脂粉，可按说明书推荐用量直接使用，无需单独称量上述干粉成分。
2. 松松盖上瓶盖（切勿完全拧紧，否则灭菌时可能爆炸！），再用铝箔 loosely 覆盖瓶口。高压灭菌后冷却至室温，再拧紧瓶盖，室温保存LB液体培养基。
3. 准备接种时，将适量LB液体分装至试管或锥形瓶，并加入相应抗生素至终浓度。
注：若计划进行质粒小提（miniprep），通常取2 mL LB于Falcon管中；若需大量提取（如中提或大提），可用高达1 L LB装入2 L锥形瓶（Erlenmeyer flask）中。
4. 用无菌枪头或牙签，从LB琼脂平板上挑取单个菌落。
5. 将枪头或牙签浸入含抗生素的LB液体中，轻轻搅动。
注：也可使用长牙签挑取菌落后，在LB中搅匀，随后取出再进行培养。
6. 用无菌铝箔覆盖培养管口，或使用非密封盖（如透气盖、双位卡扣管、透气膜等），以保证充分通气。
7. 将培养物置于37°C摇床中振荡培养12–18小时。
注：某些质粒或菌株需在30°C下培养。此时因生长速度较慢，可能需要更长时间（如18–30小时）才能达到所需菌体密度。
strong>8. 培养结束后，观察是否生长——成功生长的培养液呈浑浊状（图1）。
注意事项：
• 某些实验要求细菌处于对数生长期（log phase）。请查阅具体实验方案，必要时通过测定OD600来评估菌液密度。
• 良好的阴性对照为：含抗生素但未接种细菌的LB培养基。过夜培养后应无任何生长。
9. （可选）如需长期保存菌种，可制备甘油菌（glycerol stock）。
10. 现可按照“质粒DNA提取”（Isolating Your Plasmid DNA）操作步骤从该培养物中提取质粒DNA。
图1：无细菌生长的培养基（左）与有细菌生长的培养基（右）
抗生素配制（Preparing Antibiotics）
1. 配制抗生素母液（stock solution）。
除非另有说明，抗生素粉末通常溶于去离子水（dH₂O）。建议配制1000×母液，分装后–20°C保存。
2. 使用时，按1:1000比例将母液加入LB培养基。
例如：配制100 mL含氨苄青霉素（ampicillin）的LB培养基，需向100 mL LB中加入100 μL 100 mg/mL的氨苄青霉素母液（即1000×）。
常用抗生素及其推荐工作浓度（Antibiotic Concentrations）
| 常用抗生素（Commonly Used Antibiotics） | 推荐工作浓度（Recommended Concentration） |
|---|---|
| Ampicillin（氨苄青霉素） | 100 µg/mL |
| Bleocin（博来霉素） | 5 µg/mL |
| Carbenicillin（羧苄青霉素） | 100 µg/mL |
| Chloramphenicol（氯霉素） | 25 µg/mL |
| Coumermycin（香豆霉素） | 25 µg/mL |
| Gentamycin（庆大霉素） | 10 µg/mL |
| Kanamycin（卡那霉素） | 50 µg/mL |
| Spectinomycin（壮观霉素） | 50 µg/mL |
| Tetracycline（四环素） | 10 µg/mL |
技巧与常见问题（Tips and FAQ）高拷贝质粒与低拷贝质粒有何区别？
“拷贝数”（copy number）指单个细菌细胞内某一质粒的拷贝数量（图2）。
• 大片段质粒通常为低拷贝（low copy），每细胞仅含1–2个拷贝，需培养18–30小时才能获得足够菌量。
• 小质粒则多为高拷贝（high copy），每细胞可达50个以上拷贝，通常培养12–16小时即可。
• 某些质粒即使较小，也可能因含有特殊调控元件而表现为低拷贝。请查阅您所用质粒的信息页面，确认其拷贝类型。
图2：细菌中高拷贝与低拷贝质粒示意图（由 BioRender.com 制作）过夜培养后无任何生长，可能原因是什么？
- 延长培养时间：某些菌株生长缓慢；若在30°C而非37°C培养，通常需更长时间。
- 确认抗生素匹配：确保LB中添加的抗生素与质粒所携带的抗性基因一致。
- 使用新鲜平板菌落：若平板上的菌落不新鲜（如存放过久），应先划线接种新平板，再挑取单菌落进行液体培养。
- 增加通气量：通常摇床转速为150–250 rpm，可提高至350–400 rpm以提升菌体密度。
划线分离细菌
如果您有细菌的甘油保种管（glycerol stock）或穿刺保种管（stab culture），并计划从中纯化质粒DNA，那么您需要从该菌种中分离出一个单克隆群体（single colony）。使用新鲜划线平板上挑取的单菌落来接种液体培养物进行DNA提取，可最大限度避免最终纯化的DNA中混入多种质粒。本方案将指导您如何通过划线法在LB琼脂平板上获得单个细菌菌落。
设备（Equipment）
- 无菌牙签（Sterile toothpicks）或接种环（wire loop）
- 本生灯（Bunsen burner）或其他小型火焰源
- 恒温培养箱（Incubator）
- 记号笔（Marker）
试剂（Reagents）
- 含适当抗生素的LB琼脂平板（LB agar plate with appropriate antibiotic）
- 细菌穿刺保种管（Bacterial stab）或甘油保种菌
操作步骤（Procedure）
- 准备一块含有合适抗生素的LB琼脂平板。
- 在平板底部（非盖子）标记质粒名称和日期。建议同时注明抗生素抗性类型及您的姓名缩写。在实验室中规范标记对实验管理至关重要，推荐为所有样品/溶液建立统一的标签系统。
- 用70%乙醇喷洒实验台面，并用纸巾擦拭以灭菌。操作时应靠近火焰（如本生灯）区域，以维持无菌环境。
- 取出对应的细菌穿刺管或甘油保种管。
- 用无菌接种环、移液枪头或牙签，轻轻触碰穿刺管内生长的菌苔，或甘油管液面顶部的菌体。
- 在平板的一个区域轻柔涂布细菌，形成第一区划线（streak #1）。
另一种常用方法是采用不连续划线法：先在平板一侧划一条垂直线作为起始；然后在另一区域划水平线；再在第三区域划斜线。注意：每个新区的第一条线必须与前一区的至少一条线相交，以确保带入少量细菌用于稀释。 - 换用一根新的无菌牙签，或重新灭菌的接种环，从第一区划线末端拖过2–3次，然后在平板第二区域划出第二区划线（streak #2）。
- 再次更换无菌工具（新牙签、枪头或灭菌环），从第二区末端拖过，于平板剩余区域划出第三区划线（streak #3）。
- 将平板倒置（防止冷凝水滴落），于37°C培养12–18小时（过夜）。
- 专业提示（Pro-Tip）：
某些质粒或菌株需在30°C而非37°C下培养。例如，大型不稳定质粒在37°C时易发生重组。请在培养前确认适宜温度。 - 次日应可见清晰的单菌落（single colonies）。单菌落呈白色小点状，生长于固体培养基表面，由单个细菌增殖形成的数百万遗传一致的子代细胞构成。若菌苔过于密集、无法分辨单菌落，请重新划线至新平板以获得分离良好的单克隆。
- 获得单菌落后，即可进行后续实验，如质粒DNA提取（Recovering Plasmid DNA）或其他功能验证。
参考文献
https://www.addgene.org/
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更新日期：2026-01-14
编制人：磊子
审稿人：小藻