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分子实验笔记05：从细菌培养物中回收质粒DNA（Recovering Plasmid DNA from Bacterial Culture）以及DNA定量（DNA Quantification）

来源：武汉市灰藻生物科技有限公司　　 浏览量：26　　 发布时间：2026-01-16 09:33:19

引言（Introduction）

许多分子生物学实验需要高纯度、高浓度的质粒DNA。本文将介绍从细菌培养物中纯化质粒DNA的一般流程。

多家公司（如 NEB、Qiagen、Invitrogen 和 Promega）均提供质粒提取试剂盒，可提取从几微克到数毫克不等的质粒DNA，浓度范围通常为 150 ng/μL 至数 μg/μL。以下协议旨在概述质粒DNA纯化的基本步骤。若您使用商业试剂盒，请严格遵循其说明书操作；若希望不依赖试剂盒进行质粒小提（mini-prep），本文末尾提供了无试剂盒的碱裂解法详细方案。

DNA ligase

DNA连接酶

设备（Equipment）

  • 台式微量离心机（Desktop microcentrifuge）
  • 台式涡旋振荡器（Desktop vortexer）
  • 真空干燥装置（可选，Vacuum）

试剂（Reagents）

  • 含目标质粒的转化细菌过夜培养物（Overnight culture of bacteria transformed with your plasmid）
  • 重悬缓冲液（Resuspension buffer）
  • 变性溶液（Denaturing solution）
  • 复性溶液（Renaturing solution）
  • 2 mg/mL RNase A
  • TE饱和或水饱和的苯酚-氯仿（TE or water-saturated phenol-chloroform）
  • 氯仿（Chloroform）
  • 100% 乙醇或异丙醇（100% ethanol or isopropanol）
  • 90% 乙醇
  • 70% 乙醇
  • TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA）
  • 3 M 醋酸钠（Na-acetate, pH 4.8）

通用DNA纯化流程（Protocol: Generalized DNA Purification）

1. 培养细菌过夜培养物。

专业提示：请根据所用质粒拷贝数选择合适培养体积——低拷贝质粒需更大培养量。

2. 离心收集细菌沉淀，再进行DNA提取。

专业提示：若整管过夜培养物无法装入单个离心管，可分装至多个管或瓶中离心。

3. 弃上清，用缓冲液重悬细菌沉淀。

注：此步将细菌重新悬浮于较小体积、且与后续溶液兼容的缓冲液中。

4. 向重悬菌液中加入变性溶液。

注：此步使细菌裂解，释放内容物（包括质粒DNA）至溶液中。

5. 加入复性溶液至变性后的菌液中。

注：此步降低pH值，促使蛋白质和基因组DNA沉淀，而较小的质粒DNA则保留在上清中。

6. 离心去除沉淀（含蛋白质和基因组DNA），保留含质粒DNA的上清液。

7. 向上清中加入乙醇或异丙醇，沉淀质粒DNA。

8. 通过离心收集DNA沉淀，或将其上样至能结合沉淀DNA的纯化柱中。

9. 用70%乙醇洗涤沉淀或柱子，去除多余盐分。

10. 用去离子水或中性缓冲液（如TE）重悬DNA沉淀，或从柱上洗脱DNA。

至此，您已获得去除了细菌蛋白质和基因组DNA的纯化质粒DNA。根据所用方法不同，所得DNA的浓度与纯度会有所差异。

无试剂盒碱裂解法质粒小提（Protocol: Kit-free Alkaline Lysis Plasmid Miniprep）1. 配制以下溶液：

  • 溶液 I – 重悬缓冲液（Solution I - Resuspension Buffer）
  • 溶液 II – 变性溶液（Solution II - Denaturing Solution）
  • 溶液 III – 复性溶液（醋酸钾溶液，Solution III - Renaturing Solution / Potassium Acetate）

2. 从含目标质粒的单菌落出发，培养2 mL过夜细菌培养物。

3. 取1.5 mL培养物加入1.75 mL微量离心管中。

4. 10,000 × g 离心30秒。

5. 小心弃去上清，避免扰动细菌沉淀。

6. 加入100 μL预冷的溶液 I，重悬沉淀。

7. 涡旋振荡2分钟，直至细菌完全重悬。

8. 加入200 μL溶液 II，轻柔颠倒混匀5次。

注：溶液将变澄清且黏稠，表明蛋白质和DNA已变性。
专业提示：此步切勿涡旋！否则基因组DNA会断裂并污染质粒DNA。


9. 冰上孵育5分钟。

10. 加入150 μL预冷的溶液 III。

11. 颠倒混匀数次，形成白色沉淀（含蛋白质和基因组DNA）。

12. 冰上再孵育5分钟。

13. 12,000 × g 离心5分钟。

注：
• 沉淀含蛋白质、细胞碎片、盐及其他杂质；
• 上清含已与染色体DNA分离的质粒DNA。

14. 用移液器或小心倾倒，将上清转移至新管中。

15. （可选）向上清中加入5 μL 2 mg/mL RNase A，37°C孵育5分钟。

注：RNase A 是一种胰源性核糖核酸酶，可降解单链RNA。

16. （可选）进行苯酚-氯仿抽提（详见下方协议）。

注：该步骤可去除残留蛋白质及RNase A。苯酚与含DNA的水相混合后，蛋白质进入有机相，从而与水相中的DNA分离。

17. 加入700 μL预冷100%乙醇 或 350 μL室温异丙醇，沉淀质粒DNA。

专业提示：若用乙醇沉淀，–20°C或–80°C孵育20分钟至过夜可提高沉淀效率。

18. 弃去上清。

19. （可选）用70%乙醇洗涤沉淀。

注：此步去除残留盐分，避免干扰后续酶反应。

20. 将离心管倒置在吸水纸（如Kimwipe）上，室温晾干20–30分钟。

21. 用25–50 μL TE缓冲液重悬DNA沉淀。

苯酚-氯仿抽提DNA（Protocol: Phenol-Chloroform Extraction of DNA Samples）

1. 向水相DNA样品中加入等体积TE饱和苯酚-氯仿。

专业提示：若无TE饱和苯酚-氯仿，可用水饱和替代。

2. 涡旋30–60秒。

3. 室温最高转速离心5分钟。

注：应清晰分为三层：
• 上层：水相（含DNA）
• 中间层：白色蛋白沉淀层
• 下层：有机相（含蛋白质）

4. 用移液器小心吸取上层水相，转移至新管。

5. 向回收的水相中加入等体积氯仿。

6. 重复步骤2–4。

重要提示：苯酚-氯仿为危险废弃物，严禁倒入下水道！

乙醇沉淀法（Protocol: Ethanol Precipitation）

1. 向DNA溶液中加入2–2.5倍体积的95%或100%乙醇，以及1/10体积的3 M醋酸钠（pH 4.8）。

2. 颠倒混匀。

3. （可选）–20°C过夜，或–80°C 30分钟，或干冰上5分钟。

注：低温有助于DNA沉淀。

4. 4°C、高速（≥12,000 rpm）离心15–30分钟。

注：
• 沉淀为DNA；
• 上清含盐、残留物和水。

5. 弃上清至废液槽。

6. 打开管盖，倒置在吸水纸上沥干。

7. 加入500 μL预冷70%乙醇洗涤沉淀。

注：进一步去除盐分。

8. 室温、高速离心5分钟。

9. 弃上清。

专业提示：经70%乙醇洗涤后，DNA沉淀更难观察且附着不牢。若担心丢失，可用移液器小心吸出上清。

10. 真空干燥或倒置在吸水纸上干燥5–20分钟。

11. 用TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA）重悬干燥DNA。

专业提示：DNA重悬可能较慢，建议室温静置数小时至过夜后再定量和使用。

12. 4°C保存DNA。

技巧与常见问题（Tips and FAQ）

  • 质粒提取试剂盒是获取高浓度、高纯度质粒DNA最快捷的方法。若采用无试剂盒法，建议在通用流程第6步（取上清后）与第7步（沉淀前）之间增加苯酚/氯仿抽提，以有效去除蛋白质等污染物。
  • 同样建议在第6步后向上清中加入RNase A，以消除RNA污染。大多数商业试剂盒的重悬缓冲液中已包含RNase A。

DNA定量（DNA Quantification）

在分子克隆的多个关键阶段，快速且准确地测定DNA的浓度与纯度至关重要。这一目标通常通过分光光度计（spectrophotometer）实现。

分光光度计利用光线穿过液体时的吸光度（absorbance）或透射率来测定该液体中特定物质的浓度。不同分子对不同波长的光具有不同程度的吸收能力，大多数物质都有一个最大吸收波长（wavelength of maximal absorbance）。通过测量液体在该波长下的吸光度，即可准确估算其中目标物质的浓度。

要基于吸光度准确计算物质浓度，必须知道该物质的最大吸收波长。对于核酸（包括DNA和RNA），其最大吸收峰位于260 nm；而蛋白质（protein）的最大吸收峰则在280 nm。因此，常通过计算A260/A280比值来评估DNA样品的纯度——该比值反映了样品中核酸与蛋白质的相对含量。

如今，许多实验室配备有NanoDrop——一种微型分光光度计，仅需1 μL样品即可精确测定DNA的浓度与纯度。无论您使用的是NanoDrop还是传统分光光度计，请务必遵循您所在实验室所用仪器的厂商操作说明。

分光光度计使用技巧（Spectrophotometer Tips）

  1. 测量样品前，务必使用“空白对照”（blank）进行校准。空白应使用与DNA溶解相同的溶液（如TE缓冲液或水），但不含DNA。“空白校准”可扣除仪器本身及溶剂带来的背景信号，确保读数准确。
  2. 若使用NanoDrop，将1–2 μL经小提（mini-prep）纯化的DNA样品滴加到检测台（pedestal）上。
  3. 合上检测臂，点击“Measure”（测量），并记录显示的浓度（concentration）与纯度（purity）。

注：纯度由 A260/A280 比值表示，理想纯度范围为1.80–2.00。

  1. 对每个样品重复上述步骤。注意事项（Notes）
  • 尽管NanoDrop精度较高，但若连续测量的两个样品浓度差异极大，前一样品残留可能影响后一测量的准确性。因此，当样品间预期浓度差异显著时，建议在每次测量之间重新进行空白校准（re-zero）。
  • 溶解于水中的DNA，其浓度读数波动通常大于溶解于缓冲液（如TE缓冲液）。使用缓冲体系溶解DNA可获得更准确、更一致的定量结果。

参考文献

https://www.addgene.org/

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更新日期：2026-01-16

编制人：磊子

审稿人：小藻