分子实验笔记04：构建重组质粒之DNA连接（DNA Ligation）
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：35 发布时间：2026-01-16 09:29:39
引言（Introduction）
构建重组质粒的最后一步，是将目标插入片段（insert DNA，即目的基因或DNA片段）连接到经兼容性酶切处理的载体骨架（vector backbone）中。这一过程通过共价连接两个DNA片段的糖-磷酸骨架实现，所依赖的反应称为连接（ligation），由T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）催化完成。T4 DNA连接酶催化形成共价磷酸二酯键（covalent phosphodiester linkages），从而将核苷酸永久连接在一起。连接完成后，插入片段与载体骨架物理结合，形成完整的环状质粒，即可转化入细菌细胞进行扩增（propagation）。
大多数连接反应所用的DNA片段均来源于限制性内切酶消化（restriction enzyme digestion）。多数限制性内切酶在其识别序列上不对称切割，产生带有单链突出末端（single-stranded overhang）的DNA片段。这种突出末端被称为“黏性末端（sticky ends）”，正是它使载体与插入片段能够相互结合。当载体与插入片段的黏性末端互补配对（即突出的碱基序列彼此互补）时，两段DNA可暂时退火结合，并最终在连接酶作用下共价融合。
下图展示了经 EcoRI 酶切后产生的两个黏性末端的连接过程：
图1 EcoRI酶切产生的两个黏性末端的连接过程
通常，科学家在将插入片段克隆至载体时，会选用两种不同的限制性内切酶——一个用于5'端，另一个用于3'端。这样可确保插入片段以正确方向（orientation）插入，并防止载体在连接过程中发生自连（self-ligation）。若载体两侧的黏性末端彼此兼容（即能互相配对），则载体极易自连而非与插入片段连接。在此情况下，必须在连接前对酶切后的载体骨架进行碱性磷酸酶（phosphatase）处理：该酶可去除DNA 5'端的磷酸基团（5' phosphate），从而阻止连接酶将载体两端重新连接成环。
标准插入片段 + 载体DNA连接方案（Protocol: Standard Insert + Vector DNA Ligation）
在设置连接反应前，需先确定所用酶切后插入片段与载体的用量。具体体积取决于两者的浓度和大小。对于大多数常规克隆（插入片段小于载体），推荐使用3:1 的插入片段:载体摩尔比（molar ratio）。我们建议每次标准连接反应中总DNA量约为 100 ng。1. 在PCR管或Eppendorf管中混合以下组分：
- 载体DNA（Vector DNA）
- 插入片段DNA（Insert DNA）
- 连接酶缓冲液（Ligase Buffer）：
• 若为10×缓冲液，每10 μL反应加1 μL；
• 若为5×缓冲液，每10 μL反应加2 μL - T4 DNA连接酶：0.5–1 μL
- 用去离子水（H₂O）补足至总体积10 μL
注意事项：
• 若DNA浓度过低，无法在10 μL体系中加入100 ng总DNA、缓冲液和连接酶，可按比例扩大反应体系，但需同比例增加缓冲液用量。对于较大体积的连接反应，1 μL连接酶通常已足够。
• 连接酶缓冲液含ATP，而ATP在反复冻融中易降解。建议取一支新缓冲液，一次性解冻后分装为5 μL、10 μL或20 μL小份，–20°C保存。后续实验每次使用一管仅解冻过一次的分装液。
• 务必设置对照！详见下方“技巧与常见问题”。
• 可尝试不同载体:插入片段比例以优化连接效率，详见下方优化建议。2. 将反应管置于室温孵育2小时，或16°C过夜（请遵循厂商说明书）。
注：许多连接反应（尤其是使用“高浓度”连接酶时），室温孵育5分钟即足够。对于较难连接的情况（如退火寡核苷酸的连接），37°C孵育可提高连接效率。3. 连接完成后，直接进行细菌转化（bacterial transformation）。
图2 DNA连接酶
技巧与常见问题（Tips and FAQ）必须设置对照（Do controls）
进行连接实验时，务必设置“仅载体 + 连接酶”对照（vector alone + ligase control）。该对照可用于验证：
• 载体是否被完全酶切；
• 若进行了磷酸酶处理，该处理是否有效。
理论上，此对照应无菌落生长，但实际操作中常有少量背景菌落。关键在于：您的“载体+插入片段”连接组应产生显著多于该对照的菌落数。
鼓励设置更多对照，尤其在连接失败需排查原因时。下表列出了常用对照及其意义：
| 对照类型（Control） | 是否加连接酶（Ligase） | 结果解读（Interpretation） |
|---|---|---|
| 未酶切载体（Uncut vector） | – | 验证感受态细胞活性及质粒抗生素抗性是否正常 |
| 酶切载体（Cut vector） | – | 检测因未完全酶切而残留的完整载体造成的背景 |
| 酶切载体（Cut vector） | + | 检测载体自连背景——对经磷酸酶处理的载体尤其重要 |
| 仅插入片段或水（Insert or water） | + | 若有菌落，表明连接或转化试剂中存在完整质粒污染优化载体:插入片段比例（Optimizing the Vector:Insert Ratio） |
虽然3:1（插入:载体）的摩尔比通常适用，但在该比例效果不佳或进行复杂克隆时，可进一步优化比例。需注意：所谓“3:1”实际上是指可用于连接的DNA末端摩尔数之比。
简单来说，无论DNA片段多长，每条线性DNA分子仅有两个末端。因此，为达到“每1个载体末端对应3个插入片段末端”的理想比例，必须根据DNA片段的实际长度调整其质量用量。
例如：若载体为5 kb，插入片段为1 kb，则相同质量下，插入片段的摩尔数是载体的5倍。此时若仍按质量比3:1加入，实际末端摩尔比将远高于3:1，可能导致多联体（multimer）形成。因此，应通过计算调整质量比，使末端摩尔比接近3:1，以获得最佳连接效率。
图3 插入片段比例参考公式
参考文献
https://www.addgene.org/
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更新日期：2026-01-14
编制人：磊子
审稿人：小藻