分子实验笔记03：诊断性限制性酶切（Diagnostic Restriction Digest）

引言（Introduction）

限制性内切酶（Restriction enzymes）是细菌天然产生的核酸内切酶，能识别多种特定的DNA序列。

由于这类酶种类繁多，且各自识别独特的序列，限制性酶切（restriction digest）已成为科研人员，将特定DNA片段从一个质粒转移到另一个质粒时，最常用的方法。

诊断性限制性酶切（Diagnostic restriction enzyme digest），正是利用了限制性内切酶在特定序列（称为限制性位点，restriction sites）处切割DNA的特性。

通常，质粒中插入片段（insert）和载体骨架（vector backbone）的大小是已知的，因此该技术可快速用于验证所构建质粒的正确性。

诊断性酶切的目标是将质粒切割成若干特定大小的片段，并通过凝胶电泳（gel electrophoresis）分析这些片段。

电泳图谱中的条带模式，可判断质粒是否含有预期大小的插入片段。通过选择合适的酶，既可以将质粒线性化以确定整个构建体的大小，也可以部分或完全切出插入片段。

在开始诊断性酶切前，需先选择能切割您质粒的限制性内切酶。许多DNA分析工具（如 Addgene 的 Sequence Analyzer）可帮助您识别给定序列中存在的限制性位点。

常用商品化限制性内切酶列表可参考 New England Biolabs（NEB）官网。

设备（Equipment）

• 电泳槽（Electrophoresis chamber）
• 移液器（Pipetman）
• 移液枪头（Pipet tips）

试剂（Reagents）

• 待测质粒的液体DNA样品（推荐用量见下文）
• 合适的限制性内切酶（具体用量请参照厂商说明书）
• 相应的限制性酶切缓冲液（Restriction digest buffer，参照厂商说明）
• 上样染料（Gel loading dye）
• 电泳缓冲液（Electrophoresis buffer）

验证质粒总大小 — 或 — 插入片段与载体骨架大小（Verifying Total Plasmid Size -OR- Insert and Backbone Size）

最简单的诊断性酶切形式是仅需确认所提质粒是否为预期大小，或由预期大小的载体骨架与插入片段组成。这种验证常在完成基于PCR或限制性酶切的克隆后进行，用于筛选单个克隆，避免直接采用成本更高的验证方法（如DNA测序）。

图1 验证质粒总大小

如上图示例：使用酶 RE1 单酶切可将6200 bp的环状质粒线性化，产生一条6200 bp的单一DNA条带；而同时使用 RE1 和 RE2 双酶切，则会得到两条带——1200 bp的插入片段和5000 bp的载体骨架。

通过“质粒指纹图谱”验证质粒身份（Verifying Plasmid Identity by "Plasmid Fingerprinting"）

有时，仅知道“插入片段为1200 bp、载体为5000 bp”并不足以确认质粒身份。因为许多质粒在使用多克隆位点（MCS）中常见的限制性酶切后，会产生相似大小的条带，导致简单酶切无法有效区分。

这种情况尤其常见于：从其他实验室获得质粒、或从–80°C冰箱中取出一份存档质粒但不确定其确切身份时——尽管您手头有质粒图谱，并清楚它“应该是什么样子”。

此时，一种有效的策略是“质粒指纹图谱（plasmid fingerprinting）”：选择一种或多种限制性内切酶，将质粒切割成3–8个片段，要求：
• 所有（或大部分）片段足够小，可在凝胶上准确测定大小；
• 各片段大小差异明显，易于分辨。

通过这种方式，即使多个质粒都含有5 kb载体+1.2 kb插入片段，也能凭借独特的条带图谱加以区分。

图2 验证质粒身份

为提高可靠性，建议选择两种不同的酶分别进行酶切，获得两套独特且互补的图谱。如上图所示：单独用 RE3 或 RE4 酶切均可产生可预测的条带模式；若两者结果均符合预期，则可高度确信质粒正确无误。

通过限制性酶切验证插入片段方向（Verifying Insert Orientation by Restriction Digest）

若通过单一限制性酶切位点将插入片段克隆至载体中，则必须验证其方向是否正确——这同样可通过限制性酶切实现。（尽管单酶切克隆并非理想策略，但有时难以避免。）在此情况下，插入片段以正向或反向连接的概率各为50%，因此唯一办法是筛选出方向正确的克隆。

如下图所示：要区分两个仅在插入片段方向上不同的克隆，可选择一种（或多种）满足以下条件的酶：
• 在插入片段内部有一个切割位点，且该位点显著偏离中心（理想位置约为距一端1/3处）；
• 在载体骨架上、插入片段的一侧也有一个切割位点。

如此设计后，两种方向将产生不同大小的酶切产物。只需将酶切产物跑胶，条带大小符合预期的克隆即为方向正确的阳性克隆。

图3 验证插入片段方向

参考文献

https://www.addgene.org/

敬请关注灰藻生物，共筑健康未来！
— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

灰藻生物：我们期待着与客户共同成长，共创生命科学的美好未来！

更新日期：2025-12-30

编制人：磊子

审稿人：小藻