分子实验笔记02：细菌转化（Bacterial Transformation）和甘油保种（Bacterial glycerol stocks）

引言（Introduction）

转化（Transformation）是指将外源DNA导入细胞的过程。利用质粒对细菌进行转化，对细菌本身的研究至关重要，也是因为细菌需要被用作质粒的储存与复制载体。

几乎所有质粒（包括专为哺乳动物细胞表达设计的质粒）都携带一个细菌复制起点（bacterial origin of replication）和一个抗生素抗性基因（antibiotic resistance gene），以便在细菌中作为可筛选标记（selectable marker）使用。

科学家已对细菌进行多种遗传改造，以获得更易于转化、且能稳定维持质粒结构（避免质粒DNA重排）的菌株。

此外，还发现了特定处理方法可显著提高转化效率（transformation efficiency），使细菌对化学法或电穿孔法（electrical-based transformation）更敏感，从而制备出通常所称的“感受态细胞（competent cells）”。

目前许多公司出售冷冻保存的感受态细胞，解冻后即可实现最佳转化效率。为获得最高转化效率，强烈建议严格遵循所购感受态细胞附带的操作说明。

甘油菌（Bacterial glycerol stocks）是质粒长期保存的重要手段。虽然质粒DNA可于 –20°C 保存，但许多实验室仍会将携带质粒的细菌制成甘油菌种。

这样，当需要再次大量提取质粒时，目标质粒已存在于所需菌株中，无需重新购买感受态细胞（competent cells）或重复转化（retransform）步骤。

接种在 LB 琼脂平板上的细菌可在 4°C 保存数周。但若需更长期保存，则必须制备甘油菌种。甘油（glycerol）的加入可稳定冷冻状态下的细菌，防止细胞膜受损，从而维持细菌活性。制备好的甘油菌种在 –80°C 可稳定保存多年。

专业提示（Pro-Tips）

市售感受态细胞的转化效率差异显著：
- 低效型细胞（通常价格较低）适用于质粒的常规储存与扩增；
- 高效型细胞：DNA用量极少、或需同时转化多个质粒时。

为节省成本，许多实验室也自行制备感受态细胞。该方法相对简单，适用于对转化效率要求不高的实验。

设备（Equipment）

• 37°C 摇床培养箱（Shaking incubator at 37 °C）
• 37°C 静置培养箱（Stationary incubator at 37 °C）
• 42°C 水浴锅（Water bath at 42 °C）
• 装满冰的冰盒（Ice bucket filled with ice）
• 微量离心管（Microcentrifuge tubes）
• 无菌涂布棒（Sterile spreading device）

试剂（Reagents）

• 含相应抗生素的 LB 琼脂平板（LB agar plate with appropriate antibiotic）
• LB 或 SOC 培养基（LB or SOC media）
• 感受态细胞（Competent cells）
• 待转化的 DNA（DNA you'd like to transform）

操作步骤（Procedure）

（1）细菌转化

1. 从 –80°C 冰箱取出感受态细胞，在冰上解冻（约需 20–30 分钟）。

2. 从 4°C 取出含相应抗生素的 LB 琼脂平板，室温回温，（可选）再置于 37°C 培养箱中预热。

3. 在微量离心管或 Falcon 管中，将 1–5 μL DNA（通常含 10 pg – 100 ng）加入 20–50 μL 感受态细胞中，用手指轻弹管底数次，轻柔混匀。

专业提示：将插入片段连接至载体的连接产物进行转化时，其转化效率通常比完整质粒对照低约 10 倍。

4. 将细胞/DNA 混合物置于冰上孵育 20–30 分钟。

5. 热激处理：将转化管下半部（约 1/2 至 2/3）浸入 42°C 水浴中 30–60 秒（通常 45 秒为佳，具体时间依感受态细胞类型而定）。

6. 迅速将管放回冰上，静置 2 分钟。

7. 向细菌中加入 250–1000 μL 不含抗生素的 LB 或 SOC 培养基，于 37°C 摇床中培养 45 分钟。

专业提示：此“复苏培养（outgrowth）”步骤使细菌有足够时间表达质粒所携带的抗生素抗性蛋白，从而能在含抗生素的平板上生长。该步骤对氨苄青霉素（Ampicillin）抗性并非必需，但对其他抗生素（如卡那霉素、氯霉素等）则至关重要。

8. 将全部或部分转化液涂布于含相应抗生素的 10 cm LB 琼脂平板上。

专业提示：建议将 50 μL 涂布于第一块平板，其余涂布于第二块平板。这样既可提高获得单菌落的概率，又能确保回收所有转化子。
若培养液体积过大，可先低速离心收集菌体，再用少量 LB 重悬，避免平板上液体过多。若琼脂表面未充分干燥即开始细胞分裂，细菌会随液体扩散，无法形成清晰菌落。

9. 将平板倒置于 37°C 培养箱中过夜培养。

图1 细菌转化

（2）细菌甘油冻存

1. 按照“接种过夜液体培养”（Inoculating an Overnight Liquid Culture）的标准流程操作。

2. 待细菌生长后，取 500 μL 过夜培养物，加入含 500 μL 50% 甘油的 2 mL 螺口冻存管（screw top tube）或冻存管（cryovial）中，轻柔混匀。

注意事项：
• 50% 甘油溶液由 100% 甘油用去离子水（dH₂O）稀释配制而成。
• 不建议使用卡扣式管盖（snap top tubes），因其在 –80°C 下可能意外弹开。

3. 将甘油菌种管置于 –80°C 冻存。只要始终维持 –80°C，该菌种可稳定保存多年。反复冻融会显著缩短其保质期。

4. 从甘油菌种中复苏细菌时，打开管盖，用无菌接种环、牙签或移液枪头轻轻刮取管壁顶部少量冻结菌体。切勿让甘油菌种完全解冻！将刮取物划线接种于 LB 琼脂平板上。

5. 在适宜温度下过夜培养细菌。具体培养条件（包括质粒拷贝数、培养温度等）可参考您所用质粒的信息页面。次日即可开始接种新的过夜培养物，用于后续质粒DNA提取。

技巧与常见问题（Tips and FAQ）

如何节省转化操作时间？

若对转化效率要求不高（例如仅需扩增已有质粒），可通过简化或跳过部分步骤大幅缩短时间，仍可获得足够菌落用于后续实验。但请注意：每项简化均会降低转化效率，高效率需求时请务必遵循完整流程。
• 用手握持代替冰上解冻感受态细胞
• 将步骤 4 的冰浴时间从 20–30 分钟缩短至 2 分钟
• 缩短或省略复苏培养步骤（氨苄青霉素抗性可完全省略；其他抗生素建议至少复苏 20–30 分钟）转化大片段质粒（>10 kb）或 BAC 时几乎无转化子，怎么办？

化学法制备的感受态细胞操作简便，但对大片段质粒摄取效率较低。若需转化大片段 DNA，建议使用电转感受态细胞（electro-competent cells）。该方法通过施加电磁场（而非热激）诱导细胞膜通透性，使 DNA 进入细胞。操作需配备电穿孔仪（electroporator）及专用电击杯（cuvettes），请严格遵循厂商说明书。未获得任何转化子，可能原因是什么？

请检查：
• 所用 LB 琼脂平板是否含有正确的抗生素；
• 质粒上的抗性基因是否与平板中的抗生素匹配。

建议设置阳性对照（许多公司随感受态细胞提供阳性对照质粒），以验证转化流程是否正常。小贴士：有时“少即是多”

尽管看似反直觉，但在使用高转化效率感受态细胞时，减少 DNA 用量反而常能获得更高转化效率。例如，若连接反应体系含 100–1000 ng 总 DNA，取 1 μL 进行 1:5 或 1:10 稀释后再转化，往往比直接使用 1 μL 原液获得更多菌落。

• 长期保存的最佳甘油终浓度尚无统一标准，但多数实验室采用 15–25% 的甘油浓度保存细菌。
• 您可在提取质粒DNA的同一天制备甘油菌种。早晨取出液体培养物后，在开始小量质粒提取（mini-prep）前，先取 500 μL 培养物用于制备甘油菌种。
• 尽量避免对甘油菌种进行多次冻融。在划线接种时，将甘油菌种管置于干冰（dry ice）上操作，可防止其完全解冻，从而延长保存寿命。
• 冻存前务必充分混匀甘油菌液（上下颠倒 5–6 次），确保形成均一溶液，无分层现象。
• 在将样品放入 –80°C 前，务必同时在管身和管盖上清晰标注信息。冷冻后的管子难以书写，且长期存放于 –80°C 的标签容易脱落或模糊，导致样品无法识别！

参考文献

https://www.addgene.org/

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更新日期：2025-12-29

编制人：磊子

审稿人：小藻