分子实验笔记01：琼脂糖凝胶电泳操作指南

引言（Introduction）

凝胶电泳（Gel electrophoresis） 是实验室中用于按DNA片段大小（如碱基对长度）进行分离、可视化和纯化的标准方法。

该技术利用电场驱动带负电的DNA分子穿过琼脂糖凝胶基质（agarose gel matrix），向正极迁移。较短的DNA片段在凝胶中迁移更快，较长的则较慢。

因此，通过将待测DNA样品与DNA分子量标准（DNA ladder）（即已知长度的DNA片段混合物）一同电泳，可估算目标DNA片段的大致长度。

设备（Equipment）

• 制胶托盘（Casting tray）
• 梳子（Well combs）
• 电源（Voltage source）
• 电泳槽（Gel box）
• 紫外光源（UV light source）
• 微波炉（Microwave）

试剂（Reagents）

• TAE 缓冲液（配方见篇尾）
• 琼脂糖（Agarose）
• 溴化乙锭（Ethidium bromide, EtBr），母液浓度为 10 mg/mL
• 上样缓冲液（Gel loading buffer），New England Biolabs 货号 B7022S

操作步骤：配制标准 1% 琼脂糖凝胶（Pouring a Standard 1% Agarose Gel）

1. 称取 1 g 琼脂糖。

专业提示（Pro-Tip）： 琼脂糖凝胶常用浓度范围为 0.7%–2%，具体取决于需分离的DNA片段大小。

只需调整固定体积缓冲液中琼脂糖的质量即可配制不同浓度凝胶（例如：100 mL TAE 中加入 2 g 琼脂糖，即得 2% 凝胶）。

2. 将琼脂糖粉末与 100 mL 1×TAE 缓冲液混合于可微波加热的烧瓶中。

专业提示： 也可使用 TBE 缓冲液 替代 TAE，各实验室通常固定使用其中一种，两者差异极小。
注意：务必确保制胶所用缓冲液与电泳槽中的运行缓冲液一致——切勿混用不同缓冲体系，也切勿用水代替缓冲液。

3. 微波加热 1–3 分钟，直至琼脂糖完全溶解

（避免过度沸腾，否则缓冲液蒸发会导致最终凝胶浓度偏高。许多人倾向采用“脉冲式”微波加热，并在加热过程中偶尔摇晃烧瓶以助溶解）。

警告（Caution）： 高温！搅拌时务必小心，溶液可能发生暴沸（eruptive boiling）。

专业提示： 建议先微波 30–45 秒，暂停并轻轻摇匀，再继续加热至沸腾。全程密切观察，因溶液极易溢出。可在瓶口覆盖一层保鲜膜（Saran wrap）以防溢出，但若全程专注监控，亦可省略此步。

4. 将琼脂糖溶液冷却至约 50°C

（手感温热但可长时间握持烧瓶），约需 5 分钟。

5. （可选）加入溴化乙锭（EtBr），终浓度约为 0.2–0.5 μg/mL

（通常每 100 mL 凝胶加入实验室母液 2–3 μL）。EtBr 可嵌入DNA双链，在紫外光（UV light）下使DNA显影。

警告： EtBr 是已知诱变剂（mutagen）。操作时必须穿戴实验服、护目镜及手套。

注意： 若在凝胶中添加了 EtBr，则电泳运行缓冲液中也应加入等量 EtBr。若未添加，则需在电泳结束后将凝胶浸泡于 EtBr 溶液中染色，再用清水脱色后方可成像。

6. 将琼脂糖溶液缓慢倒入已放置梳子的制胶托盘中。

专业提示： 倾倒时动作要慢，避免产生气泡（气泡会干扰凝胶结构）。若出现气泡，可用移液枪头将其推离加样孔区域，或推向凝胶边缘。

7. 将新制凝胶置于 4°C 冷藏 10–15 分钟，或室温静置 20–30 分钟，直至完全凝固。

专业提示： 若时间紧迫，可提前将制胶托盘预冷至 4°C，再倒入热琼脂糖溶液，可显著加快凝固速度。

上样与电泳运行（Loading Samples and Running an Agarose Gel）

1. 向每个 DNA 样品中加入上样缓冲液并充分混匀。

推荐比例：每 25 μL 样品加入 5 μL 上样缓冲液。
注意：上样缓冲液具有双重作用：
1) 含有可见染料，便于观察加样过程并判断DNA迁移距离；
2) 含高浓度甘油（glycerol），增加样品密度，使其沉入加样孔底部，避免在缓冲液中扩散。

2. 凝胶完全凝固后，将其放入电泳槽（electrophoresis unit）中。

3. 向电泳槽中加入 1×TAE（或 TBE）缓冲液，液面需完全覆盖凝胶。

专业提示： 若凝胶中已添加 EtBr，则缓冲液中也应加入 EtBr。EtBr 带正电，在电场中会向负极迁移，而 DNA 向正极迁移。

若缓冲液中无 EtBr，电泳后期会出现 DNA 在凝胶底部、EtBr 集中在顶部的现象，导致条带染色不均。此时可在电泳后将凝胶浸泡于 EtBr 溶液中染色并水洗脱色，效果与初始未加 EtBr 的处理方式相同。

4. 小心地将 DNA 分子量标准（ladder）加入凝胶第一泳道。

注意： 加样时保持移液器内正压，防止气泡或缓冲液吸入枪头。将枪头尖端轻触加样孔上方的缓冲液面，缓慢而稳定地推出样品，观察其沉入孔底。样品完全推出后，将移液器按至第二档，再垂直提起枪头。

5. 小心地将其他样品依次加入其余泳道。

6. 在 80–150 V 电压下电泳，直至染料前沿迁移至凝胶全长的 75–80% 处。

典型电泳时间约为 1–1.5 小时，具体取决于凝胶浓度与电压。
注意：电泳槽中黑色电极为负极，红色为正极。DNA 带负电，将向正极（红色）迁移——始终“Run to Red”（向红极跑）。

7. 关闭电源，断开电极连接，小心取出凝胶。

8. （可选）若未在凝胶和缓冲液中添加 EtBr

将凝胶放入含 100 mL TAE 运行缓冲液和 5 μL EtBr 的容器中，置于摇床上染色 20–30 分钟，随后更换为清水脱色 5 分钟。

9. 使用紫外成像设备观察 DNA 条带。

凝胶上的 DNA 片段通常呈现为清晰的“条带（bands）”。
专业提示： 若后续需对 DNA 进行纯化（如用于克隆），应使用长波长紫外光（long-wavelength UV）并尽量缩短照射时间，以减少对 DNA 的损伤。
注意：使用紫外光源时，务必佩戴防护眼镜或面罩、手套及实验服，保护皮肤和眼睛。

凝胶结果分析（Analyzing Your Gel）

以第一泳道的 DNA ladder 为参照（厂商说明书会标明各条带对应的碱基数），可推断样品泳道中 DNA 片段的大小。

DNA 从凝胶中纯化（Purifying DNA from Your Gel）

若进行分子克隆等下游实验，需将目标 DNA 从琼脂糖凝胶中切胶回收并纯化。

技巧与常见问题（Tips and FAQ）如何提高条带分辨率？

提升 DNA 条带清晰度（分辨率）的简单方法包括：
a) 降低电压、延长电泳时间；
b) 使用更宽/更薄齿的梳子；
c) 减少每个加样孔中的 DNA 上样量。
对于非常短的 DNA 片段（5–500 bp），可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），其分辨率优于琼脂糖凝胶。如何改善条带分离效果？

若目标条带大小相近、迁移位置重叠，可通过调整琼脂糖浓度优化分离：
- 高浓度凝胶（如 2%）更适合分离小片段 DNA；
- 低浓度凝胶（如 0.7%）更适合分离大片段 DNA。“10% 规则”（10% Rule）

为每个样品准备比实际所需多 10% 的体积，以补偿移液过程中的损耗。例如：若计划上样 10 μL（含 1.0 μg DNA），应配制 11 μL（含 1.1 μg DNA）。

TAE 缓冲液配制方法（TAE Recipe）

1 L 50× TAE 储备液配方：
- Tris-base：242 g
- 冰醋酸（100% acetic acid）：57.1 mL
- 0.5 M EDTA（Na₂EDTA）：100 mL
用去离子水（dH₂O）定容至 1 L。
配制 1× TAE 工作液：取 20 mL 50× 储备液，加去离子水稀释至 1000 mL（即 980 mL 水）。

参考文献

https://www.addgene.org/

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更新日期：2025-12-29

编制人：磊子

审稿人：小藻