靶向测序（Targeted Sequencing）：原理、步骤、方法、用途与示意图

来源：武汉市灰藻生物科技有限公司　　浏览量：144　　发布时间：2025-12-28 12:45:31

引言

靶向测序（Targeted Sequencing）是一种仅对基因组中特定感兴趣区域进行测序的方法，而非对整个基因组进行测序。

通过聚焦于特定基因或区域，靶向测序相比全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）等更广泛的测序方法，具有更高的效率和成本效益。

靶向测序特别适用于研究复杂的基因组区域，常用于临床和科研场景中进行深入的遗传分析。

此外，在完成全基因组测序后，也常利用靶向重测序（Targeted Resequencing）对初步发现的关键位点进行更精细的验证与分析。

靶向测序的原理（Principle of Targeted Sequencing）
靶向测序的流程/步骤（Process/Steps of Targeted Sequencing）
靶标富集方法（Methods of Target Enrichment）
靶向测序的优势（Advantages of Targeted Sequencing）
靶向测序的局限性（Limitations of Targeted Sequencing）
靶向测序的应用（Applications of Targeted Sequencing）

靶向测序的原理（Principle of Targeted Sequencing）

靶向测序的核心原理是仅对特定的基因组区域进行测序。该方法通过专门的技术手段识别并富集目标DNA片段，再进行测序。

由于只关注特定区域，靶向测序可实现这些区域的高覆盖深度（high coverage depth），从而提高对遗传变异（包括罕见变异）的检出能力。

这种靶向策略不仅提升了测序深度和数据质量（即使在降解DNA等困难样本中也表现良好），还显著减少了数据分析所需的时间和计算资源，使其成为聚焦型研究的理想选择。

与全基因组测序（WGS）类似，靶向测序流程中增加了一个关键步骤——靶标富集（Target Enrichment）。该步骤通过使用特异性探针（probes）捕获目标DNA序列，或利用特异性引物（primers）进行靶向扩增，从而确保只有感兴趣的基因组区域进入后续测序环节。

靶向测序原理

靶向测序的流程/步骤（Process/Steps of Targeted Sequencing）

1. 样本制备（Sample Preparation）

首先从生物样本中提取高质量的DNA或RNA。核酸的质量直接影响下游实验效果，因此需避免污染和降解，并妥善处理。

2. 文库构建（Library Preparation）

将提取的DNA通过机械剪切（mechanical shearing）或酶切（enzymatic digestion）打断成小片段，随后进行末端修复（end repair）并连接测序接头（sequencing adaptors）。这一步确保DNA片段能与测序平台有效结合，为后续富集和测序做好准备。

3. 靶标富集（Target Enrichment）

这是靶向测序区别于WGS的核心步骤。通过以下两种主流方法，仅保留目标区域：

杂交捕获法（Hybridization Capture）：使用生物素标记（biotinylated）的寡核苷酸探针与目标DNA结合，再通过链霉亲和素包被的磁珠（streptavidin-coated magnetic beads）分离富集。
扩增子测序法（Amplicon Sequencing）：利用特异性引物通过PCR扩增目标区域，提高其在样本中的浓度。

4. 测序（Sequencing）

富集后的文库使用高通量测序平台（如Illumina）进行测序。该过程并行读取数百万条短读长（short reads），通常采用双端测序（paired-end sequencing）以提高比对准确性和结构变异检测能力。

5. 数据分析（Data Analysis）

最后进行生物信息学分析，包括：

原始数据质控（quality control）
将测序reads比对到参考基因组（alignment）
变异识别（variant calling）、结构变异分析及功能注释（annotation）

通过专业软件工具筛选高质量数据，确保结果可靠性。

靶向测序流程

靶标富集方法（Methods of Target Enrichment）

特征	杂交捕获法（Hybridization Capture）	扩增子测序法（Amplicon Sequencing）
方法原理	使用生物素化探针结合目标区域，通过链霉亲和素磁珠捕获	利用特异性引物通过PCR扩增目标区域
复杂度与速度	步骤多、耗时较长	操作简单、速度快
起始DNA量	需较多输入DNA	可用少量DNA
成本	较高（探针设计与制备复杂）	较低
覆盖均一性	覆盖更均匀	易出现覆盖不均，尤其在复杂或低质量样本中
错配容忍度	高（探针较长，容错性强）	低（引物与模板错配易导致扩增失败）
PCR重复问题	可通过UMI（Unique Molecular Identifiers）减少重复	易产生PCR重复，引入偏差
灵敏度与特异性	在低质量样本中表现更优，特异性高	易发生非特异性扩增，影响数据质量
适用场景	需高精度、高覆盖的研究（如临床诊断）	注重速度与成本的项目（如筛查）

注：UMI（唯一分子标识符）可在文库构建时加入，用于标记原始DNA分子，帮助去除PCR重复，提升定量准确性。

靶向测序的优势（Advantages of Targeted Sequencing）

高效经济：仅测序目标区域，避免无关数据带来的额外成本与计算负担。
数据量小、分析简便：生成的数据集更小，分析流程更快、更易管理。
快速出结果：相比WGS，分析周期显著缩短。
高覆盖深度：有助于检出低频或罕见变异（如肿瘤中的体细胞突变），提升变异检出准确性。

靶向测序的局限性（Limitations of Targeted Sequencing）

视野受限：仅覆盖预设区域，无法发现目标区域外的新变异，可能遗漏重要信息。
无法提供全基因组视图：不适合需要全面基因组信息的研究。
面板设计复杂：探针或引物设计不当会导致覆盖不均或扩增失败。
覆盖均一性挑战：尤其在DNA质量差或基因组结构复杂的样本中更明显。
扩增子法的固有缺陷：

靶向测序的应用（Applications of Targeted Sequencing）

临床诊断：用于快速、准确地诊断遗传性疾病（如囊性纤维化、遗传性癌症综合征）。
疾病机制研究：分析与疾病相关的生物标志物（biomarkers）和遗传变异，揭示复杂疾病的分子基础。
病原体监测：用于病毒基因组测序（如SARS-CoV-2变异追踪）和传染病暴发监控。
肿瘤精准医疗：通过癌症基因panel检测驱动突变，指导个体化治疗方案制定。
罕见变异检测：在高背景噪声下仍能有效识别低频突变。
微生物组研究：用于微生物谱型分析（microbial profiling）、宏基因组学（metagenomics）和肠道菌群（microbiome）研究。

靶向测序凭借其高深度、高效率和低成本的优势，已成为精准医学、临床检测和功能基因组研究中的关键技术。

尽管存在覆盖范围有限等局限，但在明确研究目标的前提下，它仍是比全基因组测序更实用的选择。

参考文献

Bewicke-Copley et al. (2019). Applications and analysis of targeted genomic sequencing in cancer studies. Computational and Structural Biotechnology Journal. https://doi.org/10.1016/j.csbj.2019.10.004

2.DeWitt, J., PhD. Targeted next generation sequencing (NGS) | IDT. Retrieved from https://www.idtdna.com/pages/technology/next-generation-sequencing/dna-sequencing/targeted-sequencing

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