实时荧光定量PCR（qPCR）：原理、流程、荧光标记物与应用

来源：武汉市灰藻生物科技有限公司　　浏览量：211　　发布时间：2025-12-20 14:44:05

引言

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）是一种可在PCR扩增过程中实时监测反应进程的技术。
同时，该技术还能对微量的PCR产物（DNA、cDNA或RNA）进行定量分析。

实时荧光定量PCR基于报告分子（reporter molecule）在反应过程中产生的荧光信号进行检测——随着扩增循环的进行，荧光信号强度也随之增强。

实时荧光定量PCR也被称为定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR），是分子生物学中一种基于传统PCR（polymerase chain reaction）的实验室技术。
qPCR是一种强大的技术，可实现目标DNA序列的指数级扩增。

PCR反应需要一对与目标序列互补的引物（primers）。DNA聚合酶（DNA polymerase）会延伸这些引物，生成的扩增子（amplicons）在后续循环中被再次扩增，从而实现DNA分子的指数增长。

然而，在传统PCR中，扩增完成后需通过凝胶电泳（gel electrophoresis）分析产物，过程耗时且只能在反应结束后进行。而实时荧光定量PCR克服了这一局限。

“实时”（real-time）一词即指该技术可在扩增过程中动态监测反应进展，而非像传统PCR那样仅能在反应结束后进行分析。

PCR术语对照

英文缩写	中文全称
PCR	聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）
RT-PCR	逆转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-PCR）
qPCR	实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR）
qRT-PCR	实时荧光定量逆转录PCR（Quantitative Real-Time RT-PCR）

实时荧光定量PCR原理（Principle of Real-Time PCR）

实时荧光定量PCR沿用了传统PCR的扩增原理，但不再依赖反应结束后的凝胶成像分析，而是通过专用仪器（实时PCR仪）在扩增过程中实时监测反应。

尽管存在多种监测方法，其核心机制一致：将DNA扩增量与荧光信号的产生直接关联。
在每个PCR循环中，随着目标DNA拷贝数的增加，荧光信号同步增强，仪器通过内置摄像头或检测器实时捕获并量化该信号，从而反映扩增进程。

实时PCR的原理

实时荧光定量PCR操作步骤（Steps of Real-Time PCR）

A. 扩增（Amplification）

变性（Denaturation）
在高温（通常为95°C）下使双链DNA解链为单链，并消除单链DNA的二级结构。若模板GC含量高，可适当延长变性时间。
退火（Annealing）
温度降至引物熔解温度（Tm）以下约5°C，使引物与模板DNA特异性结合。
延伸（Extension）
在70–72°C下，DNA聚合酶活性最佳，以每秒约100个碱基的速度延伸引物。
若扩增子较短，退火与延伸步骤常合并为一步（如60°C）。
实时PCR的操作步骤

B. 检测（Detection）

样品置于专用PCR板孔中，经历标准热循环。
实时PCR仪配备钨灯或卤素光源，激发样品中添加的荧光标记物。
随着DNA拷贝数增加，荧光信号同步增强。
发射的荧光由检测器捕获，经模数转换后传输至计算机，实时显示在屏幕上。
当荧光信号超过仪器设定的阈值（threshold，即最低可检测水平）时，系统记录为阳性扩增。

实时荧光定量PCR常用荧光标记物（Fluorescence Markers）

最常用的两类荧光检测系统为：

实时PCR的标记物

1. TaqMan探针（TaqMan Probe）

属于水解探针（hydrolysis probe）。
探针5'端标记报告荧光染料（如FAM，6-羧基荧光素），3'端标记淬灭基团（如TAMRA，四甲基罗丹明）。
未结合时，探针呈发夹结构，使报告基团靠近淬灭基团，荧光被抑制（淬灭）。
当目标序列存在时，探针与模板特异性结合。
在延伸阶段，Taq DNA聚合酶的5'→3'外切酶活性降解探针，使报告染料与淬灭基团分离，释放荧光信号。
每完成一个循环，荧光分子数量增加，信号强度与目标DNA扩增量呈正相关。

2. SYBR Green染料

一种可嵌入DNA双螺旋小沟（minor groove）的非特异性荧光染料。
与dsDNA结合后发出强荧光，游离状态下几乎无信号。
虽乙锭（Ethidium Bromide）或吖啶橙（Acridine Orange）也可用，但SYBR Green信号更强、更灵敏。
优势：可提供每个循环的扩增信息，并支持熔解曲线分析（melting curve analysis），用于验证扩增特异性。
劣势：因非特异性结合，可能产生假阳性信号，特异性低于TaqMan探针。

实时荧光定量PCR的优势（Advantages）

相比传统PCR，qPCR具有以下显著优势：

可实时监控反应进程，快速判断哪些反应成功、哪些失败；
可精确计算扩增效率；
无需跑胶，通过熔解曲线即可验证产物特异性；
支持真正意义上的定量分析（如基因表达水平），而传统PCR仅为半定量；
操作更快捷；
样品定量更简便；
可在少数几个循环后自动判定多个反应结果，避免“假阴性”问题。

应用领域（Applications）

实时荧光定量PCR广泛应用于以下领域：

基因表达分析（Gene expression analysis）
癌症研究（Cancer research）
药物研发（Drug research）
疾病诊断与管理（Disease diagnosis and management）
病毒载量定量（Viral quantification）
食品安全检测（Food testing）
转基因食品鉴定（GMO food detection）
动植物育种（Animal and plant breeding）
基因拷贝数分析（Gene copy number variation）

参考文献

https://www.mun.ca/biology/scarr/Principle_of_RT-PCR.html

http://www.primerdesign.co.uk/assets/files/beginners_guide_to_real_time_pcr.pdf

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