噬菌体复苏与高效价滤液制备的标准化流程
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：6 发布时间：2025-12-23 21:21:40
引言
噬菌体作为最具多样性的生物实体，在基础微生物学、合成生物学及新型抗菌策略研发等领域发挥着不可替代的作用。其保藏后的复苏效率与活性稳定性是决定后续实验成功与否的首要环节。
目前，液体悬浮低温保存与真空干燥长期保存是两种主流保藏方式，本文基于德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）的标准操作规程，结合噬菌体-宿主互作的生物学特性，对两种复苏方法进行了系统性的梳理、对比与优化，以期为相关领域研究人员提供一套完整、可靠的技术参考。
图1、噬菌体示意图
材料与方法
主要试剂与设备
表1：关键试剂与设备列表
| 类别 | 名称 | 规格/型号 | 主要用途 |
|---|---|---|---|
| 缓冲液 | SM缓冲液 | 100 mM NaCl, 8 mM MgSO₄, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2% 明胶（可选） | 噬菌体稀释、洗脱与保存 |
| 培养基 | 软琼脂（顶层） | 琼脂浓度0.5%-0.7%（依噬菌体特性优化） | 双层琼脂法铺板 |
| 底层琼脂平板 | 相应宿主菌固体培养基 | 提供营养基底 | |
| 耗材 | 无菌滤膜 | 0.22 μm 孔径，低蛋白吸附 | 制备无菌噬菌体滤液 |
| 设备 | 低温高速离心机 | 最大转速 ≥ 12,000 × g | 去除细菌碎片 |
| 恒温水浴锅 | 控温精度 ±1°C | 软琼脂保温（48°C） | |
| 恒温培养摇床/培养箱 | 温度范围覆盖宿主生长需求 | 宿主培养与噬菌体扩增 |
复苏方法策略选择
表2：两种噬菌体复苏方法流程对比
| 阶段 | 液体悬浮噬菌体复苏 | 真空干燥噬菌体复苏 |
|---|---|---|
| 预处理 | 取原始保存液直接使用 | 无菌开瓶，将干燥滤片于0.5-1 mL SM缓冲液中室温复水1小时 |
| 宿主准备 | 宿主菌预培养至对数早期（OD₆₀₀ ≈ 0.2-0.5） | 同上 |
| 核心扩增 | 双层琼脂法：将噬菌体稀释液与宿主菌混合于软琼脂后倾注 | 方法A（推荐）：复水滤片贴于已铺宿主菌的软琼脂平板表面 |
| 方法B（替代）：将复水滤片直接加入对数期宿主菌液中进行液体培养裂解 | ||
| 结果判读 | 计数清晰噬菌斑（PFU） | 观察滤片周围裂解圈（透明或浑浊） |
| 后续处理 | 直接进行滴度测定或滤液制备 | 需从裂解圈区域洗脱噬菌体，进行新一轮扩增或滴度测定 |
标准化实验流程
通用前期准备 (Day 1)
1. 培养基制备：配制并灭菌相应的底层琼脂培养基、液体肉汤及分装好的顶层软琼脂（3 mL/管）。
2. 宿主菌活化：将保藏的宿主菌在新鲜固体平板上划线，于适宜温度下培养过夜，获得单菌落。
液体悬浮噬菌体复苏与滴度测定 (Day 2-3)
1. 宿主菌预培养：挑取单菌落接种至3-5 mL液体培养基，振荡培养至对数早期。
2. 噬菌体梯度稀释：在SM缓冲液中进行10倍系列稀释（如10⁻¹至10⁻⁸）。
3. 双层琼脂铺板：
a. 融化顶层软琼脂，置于48°C水浴平衡。
b. 取各稀释度噬菌体液100 µL，分别与200 µL宿主菌液混匀。
c. 迅速将混合液倒入已平衡的软琼脂管中，涡旋混匀后倾注于底层平板上。
d. 设立阴性对照：仅含宿主菌的软琼脂平板。
4. 培养与观察：平板凝固后，倒置于适宜温度培养18-24小时。
5. 滴度计算：选择噬菌斑数量在30-300之间的平板进行计数。
滴度计算公式：PFU/mL = (噬菌斑数量 × 稀释因子) / 铺板噬菌体体积(mL)
真空干燥噬菌体复苏 (Day 2-3)
推荐使用方法A（双层琼脂贴片法），成功率更高。
1. 复水：无菌操作取出干燥滤片，浸入含0.5 mL SM缓冲液的无菌离心管中，室温静置1小时。
2. 制备宿主菌平板：按上述方法制备仅含宿主菌的软琼脂平板，并待其凝固。
3. 贴片与培养：用无菌镊子将复水后的滤片置于平板中央，轻轻按压确保接触。倒置培养。
4. 结果判读：培养后观察滤片周围是否形成裂解区域。注意：裂解圈可能是完全透明的（烈性噬菌体），也可能是浑浊的（某些温和噬菌体或裂解不彻底）。
真空干燥噬菌体复苏使用的，本质上仍然是“双层琼脂法”，但噬菌体的加入方式与液体样本有根本区别。
| 步骤 | 传统双层琼脂法（用于液体样本） | 改良双层琼脂贴片法（用于干燥样本） |
|---|---|---|
| 1. 底层 | 制备固体营养琼脂平板。 | 同左：制备固体营养琼脂平板。 |
| 2. 顶层混合 | 关键步骤：将噬菌体液、宿主菌液与融化的软琼脂在试管中预先混合，然后倾倒在底层上。 | 关键区别：仅将宿主菌液与融化的软琼脂在试管中混合，倾倒在底层上，形成不含噬菌体的宿主菌软琼脂层。 |
| 3. 噬菌体引入 | 已在第2步混合完成。 | 等待第2步的软琼脂层完全凝固后，将已复水的干燥滤片贴在其表面。 |
| 4. 作用机理 | 噬菌体与宿主菌在软琼脂中均匀混合，感染后形成分散的噬菌斑。 | 滤片中的噬菌体在凝固的软琼脂表面缓慢扩散并向下渗透，感染其下的宿主菌，形成以滤片为中心的裂解圈。 |
真空干燥噬菌体复苏使用的是标准的双层琼脂系统（底层+顶层软琼脂），但采用了“先铺宿主菌层，后贴噬菌体源”的改良步骤。
高效价噬菌体滤液的制备
无论采用何种复苏方法，获得噬菌体后均按此流程制备滤液：
1. 洗脱：向显示良好裂解（或噬菌斑近乎融合）的平板中加入3-5 mL SM缓冲液，室温下水平摇床低速振荡（~180 rpm）2-4小时。
2. 收集与澄清：收集洗脱液，4°C，8,000-12,000 × g 离心10分钟，去除大部分细菌碎片。
3. 除菌过滤：将上清液通过0.22 μm低蛋白吸附滤膜，所得滤液即为无菌噬菌体储备液。
4. 分装与保存：立即分装，并标记噬菌体名称、日期、滴度。可4°C短期保存（数周） 或加入终浓度为50%的甘油，于-80°C长期保存。
讨论与优化建议
1. 方法选择：液体悬浮复苏适用于已知滴度、活性较好的样本，流程快捷；真空干燥复苏适用于长期保藏的样本，双层琼脂贴片法能有效避免复水过程中噬菌体的损失，优于液体裂解法。
2. 关键控制点：
o 宿主状态：务必使用对数生长早期的宿主菌，这是获得高感染效率的前提。
o 软琼脂温度：必须精确维持在45-48°C，过高损伤宿主，过低导致提前凝固。
o 无菌操作：全程严格无菌，尤其在开启安瓿瓶和过滤环节。
3. 问题排查：
o 无裂解/无噬菌斑：检查宿主菌敏感性、噬菌体活性是否丧失、培养基成分是否正确。
o 裂解圈模糊：可能为温和噬菌体，可尝试改变培养时间或温度；也可能是噬菌体浓度过低，需进行多轮扩增。
o 滤液滴度低：确保洗脱时间充足，并检查离心力和滤膜是否合适，避免噬菌体被截留或失活。
结论
本研究系统性地建立并对比了针对不同保存形式的噬菌体实验室复苏方案，并提供了配套的高质量滤液制备标准化流程。优化后的双层琼脂法及其贴片变体被证明是可靠且高效的核心技术。通过规范宿主菌准备、温度控制、无菌操作及滴度验证等关键环节，本方案能显著提高噬菌体复苏的成功率与可重复性，为噬菌体的基础与应用研究提供了坚实的技术保障。
附录：SM缓冲液（噬菌体缓冲液）配制
1. 称量并溶解以下试剂于800 mL去离子水中：
o 氯化钠 (NaCl)：5.844 g (终浓度 100 mM)
o 七水合硫酸镁 (MgSO₄·7H₂O)：1.975 g (终浓度 8 mM)
o Tris碱：3.028 g (终浓度 25 mM)
2. 加入约50 mL 1 M HCl，将pH值精确调整至7.5。
3. 可选择性加入明胶至终浓度0.1% (w/v) 以稳定噬菌体。
4. 用去离子水定容至1 L。
5. 121°C高压灭菌15分钟，室温或4°C保存。
参考文献
https://www.dsmz.de/collection/catalogue/microorganisms/special-groups-of-organisms/phages
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更新日期：2025-12-15
编制人：小灰
审稿人：小藻