下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）的技术定义和类型介绍

来源：武汉市灰藻生物科技有限公司　　浏览量：440　　发布时间：2025-12-07 21:26:06

引言

下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）是一种强大的技术平台，能够同时对成千上万，乃至数百万个DNA分子进行测序。

NGS，也称为高通量测序（high-throughput sequencing），是用于统称多种现代测序技术的总称。
对低成本测序的强烈需求推动了高通量测序的发展，使其能够一次性产出，成千上万甚至数百万条序列。

这些技术旨在将DNA测序成本降至传统染料终止法（dye-terminator methods）无法企及的水平。

下一代测序技术工作流程

图1、下一代测序技术工作流程

因此，与此前广泛使用的桑格测序（Sanger sequencing）相比，这些新兴技术使DNA和RNA的测序速度更快、成本更低，从而彻底革新了基因组学（genomics）。

NGS按技术代际分类，克服了传统DNA测序方法的诸多局限，并已广泛应用于各类分子生物学研究场景。例如，CD Genomics等公司也提供下一代测序（NGS）服务。

下一代测序技术

图2、下一代测序技术

NGS主要分为以下几代：

第一代测序（First Generation）

桑格测序（Sanger Sequencing）

第二代测序（Second Generation Sequencing）

焦磷酸测序（Pyrosequencing）
可逆终止子化学测序（Sequencing by Reversible Terminator Chemistry）
连接法测序（Sequencing by Ligation）

第三代测序（Third Generation Sequencing）

单分子荧光测序（Single Molecule Fluorescent Sequencing）
单分子实时测序（Single Molecule Real Time Sequencing, SMRT）
半导体测序（Semiconductor Sequencing）
纳米孔测序（Nanopore Sequencing）

第四代测序（Fourth Generation Sequencing）

旨在直接在细胞内（in situ）进行基因组分析。

下一代测序的主要技术类型

1. 大规模平行信号测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS）

由Lynx Therapeutics公司开发，被认为是最早的“下一代”测序技术之一。
MPSS于1990年代由Sydney Brenner和Sam Eletr共同创立的Lynx Therapeutics公司研发。
该技术具有超高通量（ultra high throughput）特性。

在基因表达谱分析中，MPSS几乎能检测样本中的每一个转录本（transcript）。

MPSS是一种基于微珠（bead-based）的方法，采用复杂的接头连接（adapter ligation）与解码流程，每次读取4个核苷酸。
然而，这种方法容易受到序列特异性偏差（sequence-specific bias）影响，导致某些特定序列丢失。
尽管如此，MPSS输出数据的核心特征——如数十万条短DNA序列——已成为后续“下一代”测序数据类型的典型代表。
MPSS主要用于cDNA测序，以测定基因表达水平。

2. Polony测序（Polony Sequencing）

一种低成本但高精度的多重测序（multiplex sequencing）技术，可并行读取数百万条固定化的DNA序列。
该技术最初由哈佛医学院（Harvard Medical School）的George Church博士开发。
它结合了体外配对标签文库（in vitro paired-tag library）、乳液PCR（emulsion PCR）、自动化显微镜以及基于连接反应的测序化学方法，成功以>99.9999%的准确率测定了大肠杆菌（E. coli）。

3. 焦磷酸测序（Pyrosequencing）

Pyrosequencing

图3、Pyrosequencing

454 Life Sciences公司（后被罗氏诊断 Roche Diagnostics 收购）开发了并行化版本的焦磷酸测序。
该方法通过油包水乳液PCR（emulsion PCR）在微滴中扩增DNA，每个微滴包含一个DNA模板和一个包被引物的微珠，最终形成克隆簇（clonal colony）。
测序仪含有大量皮升级（picolitre-volume）微孔，每孔含一个微珠及测序酶。
焦磷酸测序利用荧光素酶（luciferase）产生光信号，检测逐个加入新生DNA链的核苷酸，综合信号生成序列读长（read-outs）。
该技术的读长和单位碱基成本介于桑格测序与Illumina、SOLiD平台之间。

4. Illumina（Solexa）

Illumina sequencing

图4、Illumina sequencing

Solexa公司开发了一种基于染料终止子（dye terminators）的测序技术。
首先将DNA分子固定在载片上的引物处，并通过“桥式扩增”（bridge amplification）进行扩增。
与焦磷酸测序不同，该方法每次仅延伸一个核苷酸。
相机拍摄荧光标记核苷酸的图像后，通过化学方法去除荧光染料及3′端阻断基团，进入下一轮循环。

5. SOLiD测序（AB SOLiD Sequencing）

该技术基于寡核苷酸连接与检测（oligonucleotide ligation and detection）。
使用一组固定长度、按测序位置标记的全可能寡核苷酸池进行测序。
其产出的序列数量和长度与Illumina测序相当。

6. DNA纳米球测序（DNA Nanoball Sequencing）

一种高通量测序技术，用于测定生物体的全基因组序列。
该方法利用滚环复制（rolling circle replication）扩增基因组DNA片段，形成DNA纳米球（DNA nanoballs）。
单次运行可测序大量DNA纳米球，且试剂成本低于其他NGS平台。
但每个纳米球仅产生短读长（short reads），使得将这些短序列比对（mapping）到参考基因组较为困难。
该技术已用于多个基因组测序项目，并计划在未来进一步推广。

7. Helioscope单分子测序（Helioscope Single Molecule Sequencing）

该技术将带有polyA尾接头（polyA tail adapters）的DNA片段固定在流动池（flow cell）表面，
随后通过循环加入荧光标记核苷酸进行延伸式测序（extension-based sequencing）。
测序由Helioscope测序仪完成，单次读长较短（最多55个碱基），
但近期方法改进显著提升了同聚物（homopolymers）。

8. 单分子实时测序（SMRT Sequencing）

基于“合成测序”（sequencing by synthesis）原理。
DNA合成发生在零模波导孔（Zero-Mode Waveguides, ZMWs）——一种底部装有捕获装置的微型孔结构中。
测序使用天然聚合酶（unmodified polymerase）和自由流动的荧光标记核苷酸。
ZMW结构设计确保仅检测孔底发生的荧光信号。
核苷酸掺入DNA链时，其荧光标记随即脱落，从而保留未修饰的DNA链。
SMRT技术还可通过观察聚合酶动力学（polymerase kinetics）检测核苷酸修饰（如甲基化）。
该方法可实现约1000个碱基的长读长。

9. 单分子实时RNA聚合酶测序（Single Molecule Real-Time RNAP Sequencing）

该方法利用RNA聚合酶（RNA polymerase, RNAP），将其固定在聚苯乙烯微珠上，
待测DNA的远端则连接另一颗微珠，两颗微珠分别置于光镊（optical traps）中。
RNAP在转录过程中移动，使两颗微珠间距发生变化，该变化可在单核苷酸分辨率下被记录。
通过依次降低四种核苷酸浓度并记录四组信号，即可推导出DNA序列。

参考文献

http://library.umac.mo/ebooks/b28050393.pdf

https://microbenotes.com/next-generation-sequencing-ngs/

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