测序的黄金标准：Sanger测序的基本原理、测序步骤和应用领域介绍

引言

Sanger测序是一种通过使用被称为双脱氧核苷三磷酸（ddNTPs）的修饰核苷酸实现链终止，从而确定DNA中核苷酸碱基顺序的方法。

该方法也被称为双脱氧测序法（dideoxy sequencing）或链终止法（chain termination method）。它由弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）及其同事于1977年首次开发，是历史上第一种DNA测序技术。

由于其高准确性和能够产生较长读长（long reads），Sanger测序长期以来被视为测序领域的“金标准”，在多种科研应用中具有重要价值。

尽管近年来DNA测序技术已取得显著进步，Sanger测序至今仍被广泛使用，尤其适用于小规模测序项目。

然而，对于高通量测序需求，下一代测序（Next-Generation Sequencing, NGS）技术（如Illumina、PacBio和Nanopore）已逐渐成为主流。

这些NGS平台能够以更低的成本、更快的速度对大量DNA进行测序，在大规模项目中已很大程度上取代了Sanger测序。不过，Sanger测序因其可靠性仍在多个领域持续发挥作用，并且随着新测序平台的发展，Sanger测序本身也实现了自动化。

图1、Sanger测序发展进展

Sanger测序原理

Sanger测序的核心原理是利用ddNTPs（双脱氧核苷三磷酸）终止DNA链的延伸。ddNTPs是DNA核苷酸的化学类似物，缺少3'端羟基（3’-OH），而该基团是形成磷酸二酯键、使DNA链继续延伸所必需的。因此，当ddNTP被掺入正在合成的DNA链中时，链延伸即被终止。

在测序反应中，将带有荧光标记的ddNTPs、普通脱氧核苷三磷酸（dNTPs）以及模板DNA混合进行类似PCR的扩增反应。由于ddNTP的随机掺入，会生成一系列长度不同、末端为特定ddNTP的DNA片段。随后通过电泳分离这些片段，根据末端ddNTP所带的荧光标签即可确定每个位置的碱基类型，从而读出完整的DNA序列。

图2、Sanger测序原理

Sanger测序的四个主要步骤

1. DNA模板制备
首先从样本中提取目标DNA，常用方法包括化学提取法、柱式提取法和磁珠法。随后制备出单链、均一的DNA模板用于后续测序。

2. 链终止PCR扩增
以目标DNA为模板，加入引物、四种dNTPs、DNA聚合酶以及少量四种荧光标记的ddNTPs（每种ddNTP对应一种碱基：A、T、C、G，并带有不同颜色的荧光染料）。

• ddNTP因缺乏3'-OH而终止链延伸；
• 由于ddNTP浓度远低于dNTP，链终止随机发生在不同位置，从而产生一系列不同长度的终止片段；
• 传统方法需在四个独立反应管中分别加入一种ddNTP；
• 自动化Sanger测序则将四种荧光标记的ddNTP置于同一反应体系中；
• 测序反应后需进行纯化（clean-up），去除未掺入的ddNTP和其他杂质，以确保电泳结果清晰。

3. DNA片段分离
通过电泳按片段长度分离DNA：

• 传统方法使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），四个反应产物分别在四个泳道中运行；
• 现代自动化平台采用毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE），每个反应在一根充满聚合物凝胶的玻璃毛细管中进行，效率更高、分辨率更好。

4. 检测与序列分析
分离后的DNA片段依次通过激光激发的荧光检测器。检测器识别每个片段末端ddNTP所携带的荧光信号，不同颜色对应不同碱基。

• 系统记录荧光信号的时间顺序，生成色谱图（chromatogram），显示各碱基对应的峰；
• 通过读取峰的顺序，即可推导出原始DNA模板的碱基序列。

Sanger测序的优势

• 被公认为测序“金标准”，准确率极高（通常 >99.99%），常用于验证NGS结果；
• 技术成熟、流程简单，结果可靠且可重复；
• 适用于小规模项目或靶向短片段测序（如单个基因或外显子）；
• 读长较长（通常可达800–1000 bp），优于多数短读长NGS平台；
• 数据分析无需复杂生物信息学工具，普通研究人员即可解读色谱图；
• 输出的色谱图清晰直观，便于人工校对和质量控制。

Sanger测序的局限性

• 通量低：一次反应仅能测序一个DNA片段，不适合大规模或全基因组项目；
• 成本高：对大型项目而言，单位数据成本远高于NGS；
• 速度慢：相比NGS的并行处理，Sanger为逐个样本测序，耗时较长；
• 灵敏度有限：难以检测低频突变（如肿瘤异质性中的稀有变异）或复杂混合样本中的次要成分；
• 对DNA样本质量要求高：降解或污染的DNA易导致测序失败或结果不可靠；
• 操作步骤相对繁琐，部分环节仍需人工干预。

Sanger测序的应用

• 医学诊断：用于检测与遗传病、癌症等相关的已知致病基因突变，是临床遗传检测的重要工具；
• 物种鉴定与系统发育研究：通过比对保守基因（如16S rRNA、COI等）序列，鉴定新物种或构建进化树；
• 法医学：用于个体识别、亲子鉴定和犯罪现场DNA指纹分析；
• 农业与育种：鉴定作物或家畜品种，辅助分子标记辅助选择（MAS）和种质资源保护；
• 新兴领域：在单细胞测序验证、合成生物学（如人工基因组装验证）等前沿技术中仍有不可替代的作用。

Sanger测序 vs. 下一代测序（NGS）

参考文献

Brown, T. (2010). Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. A John Wiley & Sons, Ltd., Publication.

Crossley, B. M., et al. (2020). Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc, 32(6), 767–775.

Sanger Sequencing: Principle, Steps, Applications, Diagram.https://microbenotes.com/sanger-sequencing/

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更新日期：2025-12-06

编制人：小藻

审稿人：小藻