聚合酶链式反应（PCR）与实时荧光定量PCR（qPCR）技术详解及对比

引言

在分子生物学领域，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）和实时荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）是两项革命性的技术。 自PCR问世以来，它便成为复制特定DNA片段的基石，极大地促进了遗传病诊断、基因克隆等领域的发展。通过一系列温度循环，PCR能够高效地放大目标DNA序列，使得微量的DNA样本也能被分析利用。 而qPCR作为PCR技术的进化版，不仅继承了其高效率和特异性，还增加了对扩增产物进行实时监测的能力，实现了对起始模板量的精确测定。这使得qPCR在基因表达分析、病原体检测等方面展现出独特优势。

本文将简要介绍这两种技术的原理、操作步骤及其各自的优势和应用，旨在为科研人员提供一个清晰的技术概览，助力于实验设计和科学研究。

原理介绍

1、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）

聚合酶链式反应（PCR）结合了核酸杂交和核酸复制的基本原理，通过温度的周期性变化实现目标DNA片段的高效扩增。 其核心机制依赖于双链DNA在高温条件下被热解为单链DNA的事实。 在此基础上，引物根据核酸杂交原则与单链DNA模板上的互补序列结合，随后，Taq DNA聚合酶从引物的3’端开始依次添加核苷酸，合成新的互补链。 这一过程分为三个主要步骤：变性（将双链DNA分离为单链）、退火（引物与单链DNA结合）以及延伸（新链合成）。 这三个步骤以循环的方式重复进行，每次循环都会使目标DNA的数量翻倍，最终经过多次循环后可生成数百万份目标核酸片段。

2、实时荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR或qPCR）采用了与传统PCR相同的扩增原理，但其独特之处在于能够在扩增过程中实时监测反应进程。 不同于传统PCR需要在反应结束后通过凝胶电泳观察结果，qPCR则是在整个反应过程中，利用实时荧光定量PCR仪中的探测器监控每一个循环的荧光信号变化。 这种监测是通过将DNA扩增与荧光信号的产生相关联来实现的，随着基因拷贝数的增加，荧光信号也随之增强。 不同的监测技术包括使用荧光染料（如SYBR Green）直接嵌入到新的双链DNA中，或是采用特异性探针标记特定序列，在每个PCR循环中检测荧光信号的变化，从而提供关于初始模板量的信息，并允许对样本中的目标核酸进行精确量化。

PCR与qPCR扩增阶段的对比

尽管PCR和qPCR的基本扩增原理相同，都包含变性、退火和延伸三个步骤，但它们在具体操作细节和目的上存在一些差异。

1、PCR扩增阶段

变性（Denaturation）：在PCR中，此步骤通过加热至约94°C（范围为90°C至95°C），持续30至90秒，使双链DNA解离成单链。

退火（Annealing）：温度降低到55°C至70°C之间，依据引物的GC含量调整。引物在此温度下与模板DNA的互补序列结合，时间为30至60秒。

延伸（Elongation）：温度升至72°C，Taq DNA聚合酶开始合成新的DNA链。根据目标序列长度和DNA聚合酶活性，延伸时间约为每千碱基对0.5至1分钟。

图1、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）原理

2、qPCR扩增阶段

变性（Denaturation）：同样是将双链DNA解离为单链，但通常使用能够耐受的最高温度（通常为95°C）。对于高GC含量的模板，可能需要延长变性时间。

退火（Annealing）：根据引物的计算熔解温度（Tm），选择适当的退火温度（通常比引物Tm低5°C）。这个步骤确保了引物能够有效地与模板结合。

延伸（Elongation）：在qPCR中，当扩增子较小时，延伸步骤有时会与退火步骤合并，使用大约60°C的温度。DNA聚合酶的最佳活性温度为70-72°C，在此温度下，引物延伸速率为每秒约100个碱基。

图2、实时荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）原理

3、主要不同点

温度控制：虽然两者都涉及变性、退火和延伸，但在qPCR中，为了适应实时监测的需求，可能会更精细地调节温度，例如合并退火和延伸步骤，并采用不同的温度设置以优化反应效率。

目的差异：传统PCR的主要目的是扩增特定的DNA片段，而qPCR不仅关注扩增，还注重于实时监控扩增过程中的荧光信号变化，从而实现对初始模板量的精确定量。

引物：引物是人工合成的短单链寡核苷酸序列，与模板DNA中的目标序列互补，长度一般为15至30个碱基。 引物为DNA合成提供了起始点，DNA聚合酶从引物的3’端开始延伸，形成新的互补链。 每个PCR反应通常需要10至12 pMol的引物。引物分为正向引物和反向引物两种，分别与模板链的不同方向结合，确保双链DNA的完整扩增。 无论是PCR还是qPCR都需要特异性引物来进行目标序列的扩增。 然而，在qPCR中，特别是当使用TaqMan探针时，除了正向和反向引物之外，还需要设计并使用特异性的探针。

探针：这是qPCR特有的成分，如TaqMan探针或SYBR Green等荧光标记物。TaqMan探针是一种特异性寡核苷酸序列，其5’端带有荧光报告基团，3’端连接有淬灭基团。在PCR过程中，随着DNA聚合酶的延伸步骤，TaqMan探针被切割，导致荧光信号增强。而SYBR Green则是直接结合到双链DNA的小沟中发出荧光，不需要额外的探针。

产物分析

1、PCR产物分析

完成PCR后，一个重要步骤是对扩增产物进行分析以确认是否成功实现了目标扩增。 最常用的方法是琼脂糖凝胶电泳（Agarose Gel Electrophoresis）。 通过这种方法，可以直观地看到扩增出的目标DNA片段的大小和纯度。 将PCR产物与上样缓冲液混合后加到凝胶孔中，在电场作用下，DNA分子根据其大小向正极迁移，较小的片段移动得更快。 随后，利用溴化乙锭（Ethidium Bromide）或更安全的替代染料如GelRed对凝胶进行染色，并在紫外灯下观察结果。 这样不仅可以验证是否产生了预期大小的DNA条带，还可以评估扩增产物的特异性。

2、qPCR产物分析

qPCR技术允许在PCR扩增的同时实时监测反应进程，基于荧光信号的变化来量化起始模板量。具体过程如下：

1）样品准备与热循环：样品首先被放入qPCR仪的适当孔中，并像常规PCR一样进行热循环处理。

2）荧光激发与检测：qPCR仪器使用钨灯或卤素光源等激发光源照射样品中的荧光标记物（如TaqMan探针或SYBR Green）。随着PCR循环次数增加，DNA拷贝数随之增加，相应的荧光信号也会增强。

3）数据转换与显示：发出的荧光信号由探测器捕捉，并转化为数字信号传输给计算机系统。软件会将这些信号处理后以图表形式展示在屏幕上，通常以Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的形式表示。Ct值是指荧光信号达到预设阈值时所经历的循环数，它与初始模板量成反比关系。

4）阈值设定与结果解读：当荧光信号强度达到设定的阈值水平（即探测器能够可靠检测到的最低信号强度）时，即可认为该样本达到了可检测水平。通过比较不同样本间的Ct值，可以确定它们之间的相对表达量或绝对数量。

聚合酶链式反应（PCR）的优势及应用

1、聚合酶链式反应（PCR）作为一种基础且强大的分子生物学技术，具有以下显著优势：

• 快速高效：PCR技术能够在短短几小时内生成数十亿个特定核酸片段的拷贝，极大地提高了实验效率。

• 高灵敏度：能够对极微量的DNA或RNA样本（0.1至5 μg）进行分析，使得从少量样本中获取大量信息成为可能。

• 简单易操作：PCR的原理和流程易于理解，实施起来相对简便。作为半自动化技术，其过程主要由热循环仪自动控制，降低了人为错误的风险。

• 缩短诊断时间：通过快速扩增目标序列，PCR显著缩短了疾病和遗传病的诊断时间，为临床决策提供了快速支持。

• 多领域基础：PCR技术为多种分子生物学技术奠定了基础，包括但不限于DNA指纹鉴定、遗传印记、微阵列、基因测序以及分子载体生产等。

2、其应用范围广泛，包括但不限于以下几个方面：

• 生物体的鉴定与分类：PCR技术被广泛应用于微生物的鉴定，可以区分不同的亚种和菌株，极大地缩短了传统方法所需的时间。

• 传染病诊断：在病原体检测中，PCR技术使得感染性疾病的诊断更为迅速准确，并且能够同时检测病原体中的耐药基因，从而指导抗微生物治疗的选择。

• 基因突变和遗传疾病的检测：PCR可用于检测基因片段中的任何突变，帮助确认是否存在遗传疾病或评估某些遗传疾病的风险。

• DNA指纹鉴定：在法医科学中，PCR被用于DNA指纹鉴定，这有助于识别罪犯或个人身份，也可用于亲子鉴定。

实时荧光定量PCR（qPCR）的优势及应用

1、实时荧光定量PCR（qPCR）在传统PCR的基础上进一步发展，提供了更多的功能和优势：

• 实时监测反应进程：qPCR允许研究人员实时观察扩增过程中的变化，这有助于判断哪些反应成功、哪些失败，并根据需要调整实验策略。

• 精确计算反应效率：通过实时监测荧光信号的变化，qPCR可以精确地计算出每个反应的扩增效率，这对于确保结果的准确性至关重要。

• 无需凝胶电泳分析：与传统PCR不同，qPCR通常不需要通过凝胶电泳来分析PCR产物，熔解曲线分析即可满足大多数需求。

• 真正的定量分析：qPCR数据可用于真正定量分析基因表达水平，而传统PCR仅能实现半定量分析。

• 自动判断反应成功与否：qPCR可以在仅几个循环后自动评估多个PCR反应的成功情况，避免了单独分析每个反应的麻烦，并解决了“假阴性”问题，提高了结果的可靠性。

2、实时荧光定量PCR（qPCR）以其高效、快速和精准的特点，在多个领域中发挥着重要作用：

• 基因表达分析：qPCR能够精确地量化基因表达水平，这对于理解基因功能及其调控机制具有重要意义。

• 癌症研究：在癌症研究中，qPCR用于检测肿瘤标志物和监测治疗效果，帮助制定个性化治疗方案。

• 基因拷贝数分析：qPCR可用于确定基因组中特定基因的拷贝数变化，这对遗传病的研究具有重要价值。

• 病毒定量：qPCR是病毒载量测定的标准方法，如HIV、HBV等病毒感染的监测。

表1、PCR与qPCR对照表

总结

聚合酶链式反应（PCR）与实时荧光定量PCR（qPCR）作为分子生物学领域的核心技术，极大地推动了科学研究和临床应用的发展。 PCR以其快速高效、高灵敏度和简单易操作的特点，广泛应用于生物体鉴定、传染病诊断、基因突变检测、DNA指纹鉴定、基因测序等多个领域。它不仅缩短了传统方法所需的时间，还为遗传疾病的研究提供了强有力的工具。 而qPCR在此基础上进一步提升了检测的精确性和实时性，能够实时监测反应进程并进行精确定量分析，适用于基因表达分析、癌症研究、病毒载量测定及食品安全检测等。 两者相辅相成，不仅在基础研究中发挥重要作用，还在医学诊断、法医科学、农业育种等领域展现了广泛应用前景。 通过这些技术，科学家能够更深入地理解生命的奥秘，并开发出更多有效的治疗方法和预防措施。

敬请关注“灰藻生物”，共筑健康未来！
— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

灰藻生物：我们期待着与客户共同成长，共创生命科学的美好未来！

更新日期：2025-04-29

#创作团队

编制人：小灰     |  审稿人：小藻