微生物耐盐性检测：原理、操作流程、结果解读与应用价值

引言

盐耐受试验是一种生化测试方法，用于检测细菌在高盐浓度（6.5%）环境下的存活能力。

不同属的细菌对环境生长条件的要求各异。除温度、pH、水分活度和营养需求外，盐度是影响细菌生长的重要因素。

所有微生物均需钠离子（Na⁺），因此一定浓度的氯化钠（NaCl）对其生存至关重要。然而，不同菌种对盐的需求量及最高耐受能力存在显著差异。

能够耐受高盐浓度（相当于或高于海水盐度）的细菌称为耐盐菌或嗜盐菌。

在盐浓度＜1.7%（＜0.2~0.3 M）环境中正常生长的细菌被视为非嗜盐菌；

需要1.7%~4.8%（0.3~0.7 M）、4.8%~20%（0.7~3.4 M）或20%~30%（3.4~5.9 M）盐浓度才能生长的细菌，分别称为轻度嗜盐菌、中度嗜盐菌和极端嗜盐菌。

若非嗜盐菌可耐受高达2.5 M的盐浓度，则称为耐盐菌。

基于细菌的盐耐受能力进行特征分析，是临床及科研实验室中细菌鉴定的重要生化检测手段。

通常，临床实验室采用6.5%盐耐受试验，来区分肠球菌属（Enterococcus spp.）与其他γ溶血性（非溶血性）链球菌属（Streptococcus spp.）。

此外，宽范围NaCl浓度的盐耐受试验也用于科研目的及细菌鉴定，例如：

区分分枝杆菌属（Mycobacterium spp.）、放线菌特征研究、极端微生物（如耐盐菌与嗜盐菌）分析以及弧菌属（Vibrio spp.）鉴定等。

本文将重点介绍诊断实验室中常用且重要的6.5%盐耐受试验。

目的

测定细菌对高盐浓度（6.5%）的耐受能力

盐耐受试验原理

向培养基中添加盐分会提高其离子浓度，进而影响细菌细胞膜的渗透压和通透性。因此，盐作为一种选择性试剂，仅允许耐盐或嗜盐微生物生长。

耐盐菌（及嗜盐菌）为适应高盐环境并繁殖，进化出多种机制。

主要包括四种：

提高胞内离子浓度至与外部环境持平；

增加胞质内相容性溶质（如与钠离子类似的钾离子）的浓度；

生理性调控细胞内水分移动过程；

以及对核苷酸和蛋白质进行修饰以在高盐环境中保持功能。

这些机制使耐盐菌能在6.5%的盐浓度下存活。然而，非嗜盐菌缺乏此类机制，因而易发生渗透压冲击、质壁分离和特定离子效应，在高盐环境中被抑制或死亡。

盐耐受试验所需材料

培养基

可采用含6.5% NaCl的改良盐肉汤进行试验。此外，添加6.5% NaCl和0.1%溴甲酚紫指示剂的脑心浸液肉汤（BHI Broth，改良BHI肉汤）也广泛用于该试验（亦可使用添加6.5% NaCl和0.1%溴甲酚紫指示剂的胰蛋白酶大豆肉汤）。

改良盐肉汤配方（每1000 mL）

HMH蛋白胨（心脏消化物）- 10.00克

蛋白胨- 10.00克

葡萄糖- 1.00克

氯化钠- 65.00克

溴甲酚紫- 0.016克

最终pH 7.2 ±0.2（25°C）

（参考文献：Modified Salt Broth (himedialabs.com)）

改良盐肉汤制备步骤

1、根据制造商说明，量取适量改良盐肉汤粉末（或各组分），按比例加入锥形瓶（或玻璃瓶）中（上述培养基需8.6克粉末/100 mL水）。

2、使用磁力搅拌器或手动搅拌均匀，加热至沸腾以使组分完全溶解。

3、分装5 mL（或其他所需体积）肉汤至试管，松散加盖或塞棉塞。

4、121°C、15磅压力下高压灭菌15分钟，冷却至40-45°C后接种。

BHI肉汤配方（每1000 mL）

小牛脑浸粉（HM浸粉）- 12.50克

BHI粉末- 5.00克

蛋白酶蛋白胨- 10.00克

葡萄糖- 2.00克

磷酸氢二钠- 2.50克

氯化钠- 5.00克

最终pH 7.4 ±0.2（25°C）

（参考文献：BHI Broth (Brain Heart Infusion Broth) (himedialabs.com)）

改良BHI肉汤制备步骤

1、根据制造商说明量取BHI肉汤粉末（或各组分）（上述配方需37.0克/1000 mL），每1000 mL培养基额外添加60.00克氯化钠和0.016克溴甲酚紫。

2、将混合物加入含1000 mL水的锥形瓶（或玻璃瓶）中。

3、搅拌并加热至沸腾以使组分完全溶解。

4、分装5 mL肉汤至试管，松散加盖或塞棉塞。

5、121°C、15磅压力下高压灭菌15分钟，冷却至40-45°C后接种。

试剂

• 氯化钠（高纯/实验级）

• 溴甲酚紫指示剂

设备

• 试管

• 培养箱

• 天平

• 高压灭菌锅

• 本生灯

• 接种环

• 个人防护装备（PPE）及其他常规实验器材

试验菌株（样本细菌）

• 阳性对照：粪肠球菌 ATCC 29212

• 阴性对照：牛链球菌 ATCC 33317

盐耐受试验操作步骤

1、用无菌接种环挑取新鲜培养（18-24小时）的单个菌落，接种于肉汤培养基中（转移1-2满环菌悬液或新鲜肉汤培养物）。

2、35±2°C有氧培养24小时，观察可见生长（浊度）或颜色变化。

3、若未见生长，继续培养至72小时，并分别于48和72小时检查浊度或颜色变化。

结果判读

• 阳性结果：表现为细菌生长（肉汤浊度增加）和/或培养基颜色由紫色变为黄色（通常于24小时内出现，但某些肠球菌菌株可能需要48至72小时，分枝杆菌属及放线菌则需长达14天）。

• 阴性结果：无细菌生长（无浊度）且培养基颜色无变化。

图1、盐耐受试验结果

质量控制

• 粪肠球菌 ATCC 29212：培养24小时后可见浊度增加且培养基变为黄色。

• 牛链球菌 ATCC 33317：即使培养72小时仍无生长且颜色无变化。

常见耐盐性致病球菌

肠球菌属（Enterococcus spp.）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）

注意事项

1、向现成培养基中添加盐时，需根据培养基原有氯化钠含量调整添加量，使终浓度精确为6.5%。

2、24小时后若结果为阴性，需继续培养至72小时再最终确认。

3、使用轻度接种物，过量接种可能导致浊度干扰而产生假阳性结果。

应用场景

• 区分肠球菌属与其他非溶血性链球菌/D群链球菌（非肠球菌）；

• 区分气球菌属（耐受6.5%盐浓度）与表现相似的其他球菌（如不耐盐的口腔球菌属和懒惰球菌属）。

局限性

1、非确定性试验，需结合其他生化测试结果以确认菌属菌种；

2、部分β-溶血性链球菌（如无乳链球菌）可在6.5%盐浓度下生长，易与肠球菌混淆；

3、微弱生长但不产酸时，浊度判读易产生歧义；

4、若细菌生长却不产酸，培养基颜色不变会导致判读困难；

5、阴性结果需至少培养72小时方可确认。

总结：

本文系统阐述了盐耐受试验（6.5% NaCl）在微生物鉴定中的应用。

文章首先阐明了该试验的核心原理：高盐环境通过改变渗透压对细菌形成选择性压力，仅具备特定耐盐机制（如调节胞内离子浓度、合成相容性溶质等）的菌株才能存活生长。

随后，详细列出了试验所需的材料、培养基配方及其制备方法，并规范了以粪肠球菌和牛链球菌作为阳性和阴性对照的标准化操作流程。

结果判读以培养基浊度增加和/或颜色变黄（产酸）为阳性标准，并强调了需培养至72小时方可确认阴性结果。

参考文献

1、Leber, Amy L., editor in chief. (2016). Clinical microbiology procedures handbook (Fourth edition). Washington, DC : ASM Press 1752 N St., N.W., [2016]

2、Tille, P. M., & Forbes, B. A. (2014). Bailey & Scott’s diagnostic microbiology (Thirteenth edition.). St. Louis, Missouri: Elsevier.

3、Vreeland RH. Mechanisms of halotolerance in microorganisms. Crit Rev Microbiol. 1987;14(4):311-56. doi: 10.3109/10408418709104443. PMID: 3308318.

4、Greenway, H & Munns, Rana. (1980). Mechanisms of Salt Tolerance in Nonhalophytes. Annual Review of Plant Physiology. 31. 149-190. 10.1146/annurev.pp.31.060180.001053.

5、Edbeib, Mohammed & Wahab, Roswanira & Huyop, Fahrul. (2016). Halophiles: Biology, adaptation, and their role in decontamination of hypersaline environments. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32. 135. 10.1007/s11274-016-2081-9.

6、Peters AC, Thomas L, Wimpenny JW. Effects of salt concentration on bacterial growth on plates with gradients of pH and temperature. FEMS Microbiol Lett. 1991 Jan 15;61(2-3):309-14. doi: 10.1016/0378-1097(91)90571-q. PMID: 1903754.

7、Conville, P. S., & Witebsky, F. G. (1998). Variables Affecting Results of Sodium Chloride Tolerance Test for Identification of Rapidly Growing Mycobacteria. Journal of Clinical Microbiology, 36(6), 1555-1559. https://doi.org/10.1128/jcm.36.6.1555-1559.1998

8、Salt Tolerance Test: Principle, Procedure, and Result (researchtweet.com)

9、Salt Tolerance Test – Principle, Procedure, Uses and Interpretation (microbiologyinfo.com)

10、What Are Halophiles – Water Content – Bedford Astronomy Club

11、How does salt concentration affect bacterial growth? – WisdomAnswer

12、Salt Tolerance Test Principle, Purpose, Procedure, Result (microbiologynote.com)

13、Salt Tolerance Test: Introduction, Principle, Procedure and Result (universe84a.com)

14、Streptococci, groups A, B, and D. Enterococcus faecalis (microbiologybook.org)

15、temperature-salt 2019 (ysu.edu)

【相关产品】

HZB358605 粪肠球菌ATCC 29212/Enterococcus faecalis

HZB365886 马肠链球菌（牛链球菌）ATCC 33317/Streptococcus equinus (NCDO 597)

敬请关注“灰藻视界”，共筑健康未来！
— 武汉市灰藻生物科技有限公司团队敬上

灰藻生物：我们期待着与客户共同成长，共创生命科学的美好未来！

更新日期：2025-09-22

编制人：小灰

审稿人：小藻