长期保存菌株，如何制备菌株冻干粉？初级干燥、二次干燥、玻璃化、保护介质、冻干设备等参数介绍
来源：武汉市灰藻生物科技有限公司 浏览量：139 发布时间：2025-09-02 14:57:26
引言
冻干细菌是一种长期保存的有效方法，该过程包含多个步骤：培养、介质/缓冲液重悬、冻干处理，储存。
本通用指南旨在，为冻干细菌的新手提供指导，每个实验室设备不同，也提供了如何利用现有材料，调整方案。
# 注意事项
1. 无万能方法： 没有一种方法适用于所有微生物，专用冻干机开发的方法，也不一定适用于其他品牌或型号。
2. 并非所有微生物都适合冻干： 某些菌株（如膜缺陷的突变体，不产孢真菌），可能无法在过程中存活，或冻干后迅速死亡。
3. 冻干介质： 脱脂奶粉溶液、蔗糖溶液，或其他冻干缓冲液，能显著提高存活率。
4. 须用玻璃容器： 空气中的水分能渗透塑料管，损坏冻干样品。在真空下火焰密封的玻璃安瓿瓶或试管，是最安全的样品容器。
5. 务必先测试： 大规模冻干前应测试方案。评估需1-2个月，结果能指示样品的长期稳定性。
6. 复溶液： 常用复溶液包括培养基（如TSA或LB肉汤），或0.9% NaCl生理盐水。
准备阶段
准备工作，可能比冻干操作本身，耗时更长，所有溶液、瓶子、塞子、玻璃棉等，都必须在开始前灭菌。
• 记录： 准确记录冻干菌种信息并使用可靠的标签方法至关重要。
建议使用纸质冻干日志记录每批样品。瓶子/试管标签必须耐用（如管壁打印机或永久性油笔手写）。一个巧妙的标签技巧是，将无菌小纸标签放入样品管内（通常贴在内壁不接触样品），随样品一同密封。
• 冻干介质： 细菌需要冻干保护剂来帮助其存活。介质可以很简单（如10%脱脂奶粉），也可以很复杂（如含动物血清的介质）。
好的介质包含两个主要成分：
o 冻干保护剂： 在去除水分时稳定细胞（如蔗糖、海藻糖）。
o 赋形剂/骨架形成剂： 使样品在冻干过程中和之后保持形状（如甘露醇、牛血清白蛋白BSA、血清、脱脂奶粉）。
常用冻干介质配方
10% 脱脂奶粉
10克脱脂奶粉溶于100毫升去离子水，高压灭菌。
成本低易制备，但效果一般，存活率通常≤10%。
10% 蔗糖
良好的冻干保护剂，存活率高于脱脂奶粉，自身也可作骨架。
但冻干时需保持较低温度，以防样品融化塌陷。
Reagent 18 (ATCC配方)
0.75克胰蛋白酶大豆肉汤 + 10克蔗糖 + 5克牛血清白蛋白BSA Fraction V，溶于100毫升去离子水。
BSA遇热变性结块，必须用0.2微米滤膜过滤除菌。效果很好，但成本较高。
微生物冻干缓冲液 (OPS Diagnostics)
商业配方，成分与Reagent 18相似，但不含动物蛋白（无BSA）
大规模冻干时，比含BSA的配方更经济。
冻干瓶/管
o 必须使用玻璃容器。 塑料（尤其是微量离心管）不适合长期储存（水分可渗透）。
o 瓶子 (Vials)： 用于带压盖板的搁板式冻干机。装入样品后盖上开槽塞（允许气体流通）。
冻干完成后，压盖板在真空下将塞子压入瓶口，大气压力使其密封。取出后通常用铝盖进一步密封。使用方便，但长期储存可能漏气，适合短期储存。
o 试管/安瓿瓶 (Tubes/Ampoules)： 长期储存冻干细菌的最佳容器。通常连接到多歧管 (Manifold) 上。样品冷冻后快速连接到多歧管。冻干完成后，用丙烷/乙炔火炬在真空下密封瓶颈。
试管： 任何硼硅酸盐玻璃试管均可。样品加入后松散地塞入无菌玻璃棉。冻干后用火焰在样品与真空管之间密封。
安瓿瓶： 因瓶颈细长，更容易火焰密封。同样需塞玻璃棉。可购买带预刻痕的安瓿瓶，便于开启。
图1、不同保藏中心的安瓿冻干粉
细菌培养与悬浮
o 使用良好无菌技术培养细菌（液体培养至稳定早期，或固体培养1-2天至菌苔浓密）。斜面培养可省去离心步骤，但液体培养通常细胞数量更多。
o 液体培养： 离心收集菌体，弃上清，用等体积冻干缓冲液重悬菌体（推荐Reagent 18或微生物冻干缓冲液，脱脂奶粉/蔗糖也可）。
o 固体培养： 用5-10毫升冻干缓冲液冲洗平板/斜面，用无菌吸管吹打菌落使其悬浮。将菌悬液转移至无菌管。
o 建议： 进行细胞计数，以便与冻干后的细胞数比较（如梯度稀释计数法）。
• 分装： 将菌悬液分装至无菌瓶/管中。每瓶只需250-500微升（约含10^8个细菌）。
• 加盖/加塞： 瓶子上放好开槽塞；试管中松散地塞入玻璃棉。开槽塞的瓶子理论上暴露于空气，但实践中污染风险低（因细菌数量巨大）。若担心污染或生物安全，可在塞子下垫玻璃棉/棉花。
冻干过程 - 搁板式冻干机
1. 开机预冷： 启动冻干机，开启冷凝器。若使用干冰/乙醇外置冷阱，也需准备好。将搁板温度设为4°C。
2. 放置样品： 将瓶子居中放在搁板上（确保压盖板能均匀下压）。
3. 冷冻： 将样品冷冻至-40°C（约需30-60分钟）。若可控温，建议以1°C/分钟速率降温。样品应明显冻结（透明液体变浑浊，脱脂奶变固体）。
4. 保温冷冻： 在-40°C保持1小时，确保完全冻结（中心样品冻结较慢）。
5. 抽真空： 开启真空泵。10-20分钟内，真空度应低于200毫托（mtorr）。
6. 一次干燥 (也称初级干燥或首次干燥)： 真空低于200毫托后，升高搁板温度进行一次干燥（水分升华阶段）。温度取决于冻干介质：
o 蔗糖介质：-25°C
o Reagent 18/微生物冻干缓冲液：最高-15°C
o (搁板与冷阱温差越大，一次干燥效率越高)
o 样品融化怎么办？ 需实验确定合适温度：将少量冻干介质样品放在搁板上，每15分钟降温一次，直至其冻结。此温度在真空和冷阱下可保证样品安全冻结。
7. 一次干燥时间： 这是最耗时的阶段。目标是在保证水分快速升华的前提下，保持样品温度低于冷阱温度。可逐步升高搁板温度（但不能超过样品融化/塌陷的温度）。时间取决于样品体积和数量。少量样品（10-20瓶，0.25-0.5ml）可能只需几小时；满载需更久。安全做法：一次干燥过夜。
8. 二次干燥 (解吸附)： 一次干燥后样品仍含约2-4%水分。升高搁板温度至20°C，干燥1-2小时以去除残余水分。过度干燥有害，最佳时间需实验确定。
9. 密封与储存： 在真空下用压盖板密封瓶子。释放真空，取出瓶子，用铝盖进一步密封。建议： 4°C避光储存。
冻干过程 - 多歧管 (Manifold)
1. 冷冻样品： 将装有菌悬液的瓶/管在-80°C冰箱，或干冰浴中冷冻。保持冷冻状态（必要时用干冰）直至连接多歧管。干冰浴速冻样品干燥较慢。
2. 开机抽真空： 启动冻干机和冷阱。关闭所有歧管阀门，开启真空泵。待真空降至200毫托或更低。
3. 连接样品： 快速连接一个瓶/管到多歧管并打开阀门（真空立即开始升华并带走热量）。依次连接剩余样品。每次打开阀门真空度会上升，但应迅速回落。若真空不降，可能该连接处漏气，关闭该阀门继续操作。
4. 干燥： 依赖环境温度提供热量驱动升华。水分减少后，样品温度逐渐升至室温（约需2-3小时）。管外结霜通常会在干燥完成后消失。
5. 火焰密封： 用乙炔火炬（丙烷也可但较慢）密封每个瓶/管。务必佩戴安全眼镜（防碎玻璃）和厚棉手套（防烫）。
6. 储存： 密封好的瓶/管在4°C避光储存。
测试与稳定性监测
• 冻干后立即测试： 用梯度稀释法比较冻干后细菌活力与原培养物活力。
• 长期稳定性监测： 在30、90、180和365天测试冻干菌种的活力。
• 评估标准：
o 好的方案存活率接近100%。
o 许多实验室认为>50%即可接受。
o 脱脂奶粉方案通常为10-20%。
o 冻干后存活率不如储存稳定性重要！ 若活力每月下降超过一个数量级（10倍），则需修改方案。
o 注意：某些菌株本身就很难成功冻干，无论如何都可能迅速死亡。
总结
| 方面 | 关键信息/要点 | 注意事项/推荐 |
|---|---|---|
| 核心目的 | 长期保存细菌 | 非所有菌种都适合；需测试方案 |
| 关键影响存活因素 | 1. 菌株本身特性 2. 冻干保护介质 (最重要) 3. 容器材质与密封方式 4. 冻干程序参数 (温度/时间) 5. 储存条件 6. 复溶液 | 必须用玻璃容器；塑料不适合长期 |
| 推荐冻干介质 | 最佳存活率： - Reagent 18 (含BSA) - 微生物冻干缓冲液 (OPS, 无动物蛋白) 尚可： - 10% 蔗糖 (需更低冻干温度) 一般： - 10% 脱脂奶粉 | BSA配方需过滤除菌；蔗糖需注意温度；脱脂奶粉成本低但存活率最低 |
| 容器选择 | 长期储存首选： - 火焰密封的玻璃安瓿瓶或试管 (真空下) 方便/短期储存： - 带开槽塞和铝盖密封的玻璃瓶 (搁板冻干机用) | 安瓿瓶最易密封；试管需火焰封口；瓶子需压盖板压塞后加铝盖密封 |
| 基本流程 | 1. 准备灭菌物料 2. 培养细菌 (液体早稳期/固体浓苔) 3. 收集菌体并用冻干缓冲液重悬 4. 分装 (250-500 µl/瓶) 5. 冷冻 (-40°C或-80°C) 6. 冻干 (一次干燥+二次干燥) 7. 密封 (压塞+铝盖 / 火焰) 8. 储存 (4°C避光) | 详细参数(温度/时间)需根据冻干机、样品量、介质优化；多歧管法依赖环境温度加热 |
| 搁板冻干关键温度 | 一次干燥 (升华)： - 蔗糖介质：≈ -25°C - Reagent 18/缓冲液：≤ -15°C 二次干燥 (解吸附)： - ≈ 20°C (1-2小时) | 一次干燥是主要耗时阶段(通常过夜)；温度过低干燥慢，过高易塌陷/融化 |
| 多歧管冻干要点 | 1. 样品需深冻 (-80°C/干冰) 2. 快速连接冷冻样品至真空多歧管 3. 依赖室温加热进行升华 (约2-3小时) 4. 干燥完成后火焰密封 | 操作需迅速防样品融化；注意佩戴护目镜和手套 |
| 质量控制 | 必须进行： 1. 冻干后立即测活力 (与原液比) 2. 定期监测稳定性 (30, 90, 180, 365天) | 目标：冻干后高存活率 + 长期储存活力稳定；若活力快速下降(如每月降10倍)，需修改方案；脱脂奶粉方案存活率通常较低 |
参考文献
Bacterial Freeze Drying Protocol
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更新日期：2025-08-24
编制人：小灰
审稿人：小藻