实验室工作开展的基础：无菌技术，节选自《动物细胞培养：基本技术和特殊应用指南（第七版）》第5章

引言

细胞培养已经发展成了一项大型的多元化技术，并广泛应用于基础研究、诊断学、再生医学和生物技术等领域。在面对细胞培养和细胞系培养的问题时，它虽然在一些专用技术上有所不同，但 许多基本过程都是共用的。通用的操作步骤只有在一定程度上标准化，获得的结果才能在不同的地点和时间重现。风险必须要明确，并给出适合的应对危险的方法。

微生物的培养同样如此，可参考细胞培养的实验规范，其中，无菌技术是其他所有技术开展的基础。

在此摘选《动物细胞培养：基本技术和特殊应用指南（第七版）》中无菌技术的章节，方便大家更好地学习和实验。

# 关键词：无菌操作、生物安全柜、无菌环境

无菌技术的目的

污染风险

污染一直是组织培养中的一个主要问题。细菌、支原体、酵母菌和真菌孢子，可能通过操作者、空气、工作台面、溶液，及其他途径被引入组织培养物，进而造成培养污染。无菌技术的目的就是，通过制定一个严格的操作规范，并确保每个人在使用设备时都要遵守，从而排除污染。

污染可以被局限在一两种培养物中，也可以在几种培养物中散布，影响整个实验；或者可能广泛传播，殃及整个实验室。

以下方法会最大限度地降低污染带来的危害：

①培养物在每次处理时，都要用肉眼或显微镜(最好用相差显微镜)仔细检查；

②培养物至少要在无抗生素培养基中生长一段时间，以发现隐藏的污染;

③使用前，对试剂进行无菌检查；

④瓶装培养基或其他试剂等，不要与他人共用，也不要用于不同的细胞系；

⑤任何时候都要保持高标准的无菌技术。支原体感染在普通显微镜下是看不见的，但它是造成污染的主要威胁之一。支原体在未被发现的情况下就能传染给实验室中其他培养物。因此必须建立一种肉眼可见的支原体检验方法，特别是细胞生长出现异常时。

维持无菌状态

正确的无菌技术，应该在培养物外部环境与培养瓶或培养皿内干净无污染的培养物之间，建立起一道屏障。

因此，所有与培养物直接接触的物品必须无菌，操作方案必须按培养物和其非无菌环境之间不能有直接联系来设计。如果不彻底改变常规的操作方法，就不可能有绝对的无菌屏障。

检查个人预防措施是否合适，是件旷日持久的工作，采用的方法在很大程度上又以一般性常识和经验为基础。无菌技术是用来减小感染可能性的各种措施的一个有序组合，其中遗漏步骤与后来发生的污染之间，并不总是绝对相关。在污染可能发生的概率增加之前，操作者或许已经疏忽了几项预防措施。

污染发生的原因通常是多方面的，找不出一个简单明确的解决办法。预防措施一旦制定，就要一直坚持下去，这样才能有效杜绝污染，即使发生也会容易检测到。

污染的概率

虽然实验室条件，在某些方面已有改善(如空调、过滤和层流设备等),但中型实验室往往比较拥挤，设备可能需要共享。如果能严格遵守合理的预防措施，无菌环境也不难维持。

但必须要求，仪器使用者严格遵守操作规范，此外要有正确的质控检测方法，同时设备检测一定要到位。

无菌环境的基本要素

由于抗生素、安全柜、空调高效滤芯的引入，这些年来，给细胞培养创造洁净区的条件，已有很大改善。由于洁净的室内空气加上层流的使用创造出了更简单、更可靠的无菌环境，没必要持续使用抗生素，而且此法也不可取。

早期的培养工作区

(a)20世纪30年代Rockefeller研究所其中的一个培养室;

(b)1961年格拉斯哥大学生化系，组织培养室中所使用的带有玻璃罩的桌子；

(c)1996年格拉斯哥大学Beatson研究所使用的生物安全柜

层流柜（生物安全柜）

在层流柜内工作的主要优点是：持续、稳定的过滤气流通过工作台面，使工作空间免受灰尘和污染。

层流方式主要有两种：

①水平式，气流从操作者对面一侧吹出，与工作面平行，并且不进行再循环;

②垂直式，气流从层流罩顶部向下吹到工作台面上，并被吸到工作台面下，最后，像生物安全柜一样，要么再循环，要么排出。

大多数柜内的气体，70%气体参与再循环，30%气体被排出并通过吸入工作台面上方空气进行弥补。这种构造设计目的是尽量减少空气从安全柜内工作区溢出。水平式层流罩提供的气流最稳定，为培养物和试剂提供了最好的无菌保护；垂直层流罩则给操作者以更多保护，尤其是使用归类Ⅱ级BSC的层流罩时。

如果处理有潜在生物危害的材料(人和其他灵长类来源的培养物、病毒感染的培养物等),最好使用Ⅱ级生物安全柜。

实际上，大多数用于细胞培养的层流罩是垂直层流生物安全柜，从现在开始统称为生物安全柜。对化学和放射性化学危害最好的防护办法是使用带有碳过滤的化学安全柜，对再循环气流进行过滤并将废物排到室外。

如果处理的是已知的人类病原体，必须使用在排气口装有病原体捕获器的Ⅲ级生物安全柜。

洁净台的气流。箭头指示气流方向。(a)水平式层流洁净台；(b)垂直式层流洁净台，作为生物安全柜使用

生物安全柜的性能，与通过滤器后的最小压降程度有关。滤器阻力增大、气压落差增加，工作区空气流速降低，当流速降到低于0.4m/s时，层流稳定性减弱，无菌状态无法再维持。压降情况可通过安全柜专用的压力计进行监控，而最好用风速表直接测量气流。

要定期对初滤器进行维护检查(每3~6个月检查一次),对水平层流罩来说，关掉风机后，可将初滤器取下丢弃，或用水和肥皂清洗。生物安全柜内的初滤器是内置式的，需要请工程师进行更换；废旧的初滤器首先进行焚烧或高温高压消毒，然后再弃去。

每6个月对工作台面上方的，高效微粒空气滤器(HEPA)的气流情况和孔数进行一次监测(可以通过局部气流和微粒数的增加进行检测)。根据鉴定的合同，检测工作最好由专业的工程师来做。生物安全柜排气口上安装的HEPA滤器，也要定期更换。如果进行的是生物危害性工作(由当地生物安全委员会来确定),在更换滤器前，要封闭工作台进行熏蒸。

应该每周定期对操作台以下部分进行检查，擦掉所有溢物、清洗托盘，先用Tego2001消毒剂，再用70%乙醇，对整个区域进行消毒。在擦拭完毕后和更换托盘前，打开紫外线灯30min可提高消毒效果。

当然，此时应立即擦洗，但也有偶尔注意不到的时候，所以有必要进行定期检查。如果在清洗时，药签、纸巾或手套掉在了操作台下面，最终会留在初滤器上而妨碍气流，所以在清洗时要小心，并用反射镜和手电筒定期检查初滤器，查看是否有杂物隐藏在管道系统内。

最好让生物安全柜持续运行，因为这样可保持工作区清洁。它们通常也是通风系统的一个组成部分，这或许是要求连续运行的原因。

使用安全柜的间隙 或 在清洁完毕后，可以用紫外线灯对生物安全柜内的空气，及暴露的工作台进行灭菌。紫外线存在辐射危害，特别是对眼睛，6个月到1年后，也会使一些干净的塑料板产生裂痕，特别是紫外线与乙醇联合使用时。

由于紫外线不能进入缝隙，而乙醇或其他液体消毒剂对其则更有效，因为可通过毛细作用渗入缝隙中。最后，在工作结束并对操作台擦拭完毕后，再进行30min的紫外线照射处理，或许是一个不错的做法。

紫外线灯需要定期更换，因为它们的光线强度会随着时间逐渐减弱。另外，也应该对紫外线灯定期清洗，以尽可能产生最大的照射强度。

# 安全提示

如果使用紫外线灯，必须戴上有保护作用的护目镜，并把暴露的皮肤遮盖好。 在紫外线照射时，生物安全柜不要打开，更不要使用。

安静区域

假如有一个单独房间，或者实验室的一个安静角落，很少或极少有人穿行，而且也无其他活动, 即使没有层流柜也能进行无菌操作。若使用生物安全柜，所选的区域不能有来自门、窗和通风设备产生的气流通过。

这个区域要禁止通行，也不能放置产生气流的装置(如离心机、冰箱、冷冻箱等);空调和静压箱应合理安放，以防排出的气体影响生物安全柜的正常运行,这个区域的活动只能限于组织培养工作，不允许进行动物和微生物的培养；

区域内应保持清洁，没有灰尘，不能放置与组织培养无关的其他仪器设备。

非无菌活动，如样品处理、染色或提取应在别处进行。

操作台

必须保持操作台的干净和整洁，应遵守如下规则。

(1)在一个十分干净的操作台上开始工作

(2)用70%乙醇充分擦洗工作台面

(3)进行实验操作时，只把需要的物品拿到操作台

(4)在两个实验操作的间隙，需要移除所有不再需要的物品，并擦洗操作台

(5)布置好工作区，以便：

   ①很容易拿到需要的物品，而不是越过某一物品，才能拿到另一个

   ②操作台中央宽敞干净(不只是操作台前缘),方便操作。如果很多物品离你太近，那将不可避免地使无菌吸管头部碰到非无菌面。另外，若操作台上挤满了物品，通风柜中的气体就不能有效地层流

(6)不要让手和其他未消毒的物品(甚至一个外部未经消毒的培养瓶)越过敞开的培养皿和培养瓶。即使在使用水平式层流柜时，也要在中心工作区和高效微粒空气滤器间没有任何障碍物的一个洁净空间工作。

(7)要在视线范围内进行操作。例如，将移液管插入洗耳球或移液管控制器中时，吸管头端指向远离你的方向，这样整个过程就会呈现在你的视线之内，不至于被胳膊遮挡

(8)立即擦去任何溢出物，并用70%乙醇擦拭该区域

(9)实验结束后，移除所有物品，并再次擦洗操作台

(10)定期打扫操作台下方空间，每周至少一次

工作区布局

水平层流超净台布局。在水平层流超净台上工作时正确的布局。 对用左手操作者来说，可以将摆放位置颠倒过来

(a) 布局正确的生物安全柜。

移液管放在左后侧，拿取方便，还能使气流到达后栏处；培养基放置在工作区左侧；培养瓶放在中间并远离前缘，移液控制器在右侧。对左手操作人员来说，可以将摆放位置颠倒过来；

(b) 布局糟糕的生物安全柜。

生物安全柜内太拥挤，许多物品堆放在前面的入气口处，从而破坏空气层流，既影响密封性又影响无菌性

个人卫生

像手套、口罩及实验服等个人防护装备有双重功能：保护操作者不受培养物带来的伤害，以及保护培养物免受操作者带来的污染。

本节着重探讨的是后者，应该戴上手套，并经常对其擦拭消毒，并且要让手套上缘与实验服的袖口重叠在一起。尽管戴上手套会降低敏感性，但它们为操作者提供了保护，而且比裸露的皮肤更容易保持清洁。

使用公共设备，手套的无菌性就会大打折扣。不像在手术室中，组织培养用手套是非无菌的，所以应该每隔一定时间用乙醇擦拭一遍。它们仅限于培养室使用，当操作者要离开培养室，或者使用电话之类的公共物品时，需要将它们脱掉。

在GMP环境下工作，必须戴上帽子和面罩，穿上长外衣(FDA,2004),但在正常情况下，特别是在生物安全柜内操作时，就不需要戴帽子和面罩了。

应该穿上实验服，并只能限于培养室内使用。

如果你有长头发，应扎在脑后；

如果在开放式工作台上进行无菌操作，禁止说话；

如果使用的是生物安全柜，而且操作者和培养物之间设有屏障，说话是允许的，但最好少说；

如果你患了感冒，则需戴一个面罩，最好不要在感染高峰期，进行任何组织培养工作。

试剂和培养基

从供应商那里购买的商业化试剂和培养基，受到严格的质量控制以确保它们的无菌性，但装它们的瓶子外侧面不是无菌的，一些生产商将瓶子用聚乙烯膜包装，这样可保持瓶子洁净，并被允许放在水浴中加热或软化。

应在生物安全柜外面拆掉包装。当从冰箱或者水槽中拿出时，要用70%乙醇擦拭这些拆掉包装的试剂瓶。

培养物

从另外一个实验室引入的培养物具有很高的危险性，因为它们可能在源头处或运送途中就已经被污染了

必须对引入的细胞系，不断地进行质检,如将它们与你自己的其他培养试剂分开处理，并坚持不添加抗生素，直到证明它们没有被污染

然后才能将它们与你的物品存放在一起

不要经常使用抗生素，因为抗生素虽然能抑制，但不能彻底消除某些污染，鼓励使用那些笨拙的技术。

无菌处理

擦拭

工作前及工作过程中，特别是有溢出物时，要用70%乙醇擦拭操作台，当实验结束后，要再次对操作台进行擦拭。

各种瓶子，特别是从低温储存室或者水槽中取来的瓶子，使用前要对它们擦拭，以后每次使用时，都要进行擦拭；

从细胞培养箱里取出的所有瓶子或盒子，使用前也都要进行擦拭。

擦拭有时会擦掉标记，所以要使用耐乙醇的记号笔。

异丙醇(IPA,也称“外用酒精”)可以代替乙醇使用，作为专用的喷雾剂或者包装好的药签使用。由于甲醇毒性较大，应避免使用。经常使用乙醇会使皮肤孔隙增多，这也是需要戴手套的另外一个原因。

其他一些物质也可用于表面消毒,但是操作者必须保证没有毒性物质的残留。

乙醇因为具有挥发性而不会有任何残留物。

常用的浓度为70%的乙醇由于蒸发速度相对较慢，因此杀菌效果最好，而且该浓度的乙醇仍具有活性。

加盖

深螺旋盖与瓶塞相比是首选，虽然在清洗盖子时要特别认真，以保证冲洗掉隐藏在橡胶衬垫后的所有洗涤剂。

最好使用无填料的聚丙烯瓶盖或一次性盖子，但如果用在玻璃瓶或玻璃管上时，瓶颈不能有缺损。

即使深聚丙烯盖(如Duran)的使用，降低了箔纸包裹的必要性，螺旋盖也要用铝箔包裹，以防瓶颈有灰尘沉积。

灼烧

灼烧往往会除去任何颗粒性灰尘或棉绒，或至少将这些颗粒性物质，粘贴到被灼烧的物品上，不至于落到无菌区域中。处理时要简单且有条不紊，不要使被灼烧的物品过热，因为这不用于物品的灭菌。

在开放式操作台上操作时，要灼烧移液管，另外，在开闭瓶子前后都要对瓶颈和螺旋盖进行灼烧。操作时要靠近火焰，由于对流，火焰附近的气流上升，可减少灰尘下沉，但不要敞开瓶口。

螺旋盖敞开一侧应朝下放到一处干净台面上，并在重新盖回瓶口之前进行灼烧。或者在移液时，也可以把螺旋盖拿在手中，以避免放下和再次灼烧。

当你在一个生物安全柜中操作时，不建议进行灼烧消毒，因为这样会干扰层流，进而影响生物安全柜的无菌，同时也会影响对生物危害性物质的防控效果。明火也可能有火灾隐患，而且会损伤HEPA滤器，熔化一部分塑料材质的内部配件。然而，只要酒精灯在生物安全柜外面，就可以用灼烧的方法蒸发掉用于消毒仪器的乙醇。

安全提示必须小心的是，被灼烧的设备直到它们完全熄灭，否则不能与乙醇接触。

试剂瓶和培养瓶

在开放式操作台上操作时，如果瓶口敞开，就不能让瓶子垂直放置，在保证瓶内液体不溢出的前提下，尽可能将它们斜放。

瓶架可用来使试剂瓶，或培养瓶保持倾斜。

打开的培养瓶应该平放，操作时像试剂瓶那样倾斜放置。

当在生物安全柜内操作时，使试剂瓶敞口并垂直放置，但不能让手或其他物品，放在敞开容器或无菌吸管，与高效微粒空气滤网之间。

当培养瓶需要平放时，斜颈培养瓶则有利于液体移液和分装。

移液

标准的玻璃吸管，或一次性塑料吸管，仍是液体转移操作最简便的方法。有时也用注射器，但普通注射器针头太短，无法伸入多数瓶子内部，因此不鼓励使用。

当用注射器转移细胞时，会产生较大的剪切力，而且这样的操作，会增加细胞接种的危险。大口径导管好于针头，但移液速度没有那么快，除非用多步进或重复分液器。

应选择量程合适的移液器；目前有100mL的一次性吸管，能用于培养基的制备和定量分装，但1mL、2mL、5mL、10mL和25mL量程的移液器，能满足大多数实验的需要。

使用快流移液器，会稍微降低其精确性。如果用玻璃吸管移液，并且每次只需要少数几个，就可以将它们一起装筒灭菌，以节省空间。

一次性塑料吸管，应该双层包装，在放入生物安全柜之前，去掉外层包装，但最好是放在一个移液管筒内。

散包塑料吸管由于不是双层包装，因此一般不推荐使用。尽管单位成本较低，但在保持无菌的同时，从散装包装中抽取吸管要比单独包装的困难。还有，实验结束后剩余未使用的吸管很难储存，也很难保持无菌，也不能转给其他操作者使用，因此只能丢弃，从而增加了单位成本。

不能用嘴吹吸管，因为已证明这是加速支原体污染的因素之一，而且可能对操作者造成一定的危害，如使用病毒感染的细胞系、人体活检组织、尸检样品或其他潜在的生物危害性材料。但可以用廉价的洗耳球，或者电动移液管控制器;从这些设备中选择一个适合自己的，并试着用同一只手持瓶盖。选择的胶头应该适用于各种大小量程的吸管，既容易安装，又不会自动脱落。液流要容易控制，而且移液速度快，同时又能精细调节。可以上下反复抽吸液体(如分散细胞),还不用担心有残留。移液管应该非常舒服地被握于手中，用一只手就很容易操作，而且不会感到疲劳。

即使是带塞子的移液管，也有液体被抽吸入洗耳球，或移液管控制器内的危险，产生微生物污染或交叉污染的危险。如果洗耳球或移液管控制器被液体污染，必须更换新的，而被污染的设备或者弃掉或者进行清洗。大多移液管控制器带的保护性滤膜需要更换。洗耳球不用这么处理，因为它们可以进行冲洗，再用70%乙醇浸泡，最后晾干即可。

移液器特别适合小剂量(≤1mL)液体的转移，虽然现在多数牌子的移液器的移液量可高达5mL。只有枪头需要灭菌，而枪头的长度限制了所用容器的大小。

如果用移液器从一个容器中抽吸灭菌液体，移液器没有灭菌的杆部，不能碰触容器的内侧面。可以对规格为10~20mL的试剂以5μL~1mL剂量分装到样品管中，或者对Bijou瓶中或者类似的小药瓶中液体进行5~200μL剂量的分装，但从较大容器中抽吸液体会有污染的风险。

较长的枪头可以用来抽吸较大剂量的液体。移液器尤其适合微量滴定，而用多道移液器就可以进行其他多孔板移液操作(图4.3b)。但移液器不适合连续传代，除非有滤网吸头。要注意区分开无RNA酶的、非无菌“PCR洁净级”枪头和无菌的、细胞培养级枪头之间的不同。

在组织培养中，移液常遇到的问题是速度和精确性之间的矛盾。在继代培养操作过程中，为尽可能减少对细胞的损伤，需要快速移液；但在细胞系维持过程中，为了实验的可重复性，则要求移液的精确性。除非是精确性要求很高的实验，在其他情况下，一般允许有±5%的误差。一般情况下，对于大多数定量实验而言，使用最小的移液管可使其结果的精确性提高，而较大的移液管能够加快连续分装速度，但精确度会降低。

要在玻璃吸管的顶端加一个棉塞，保持在使用中移液管的无菌性。新生产出的塑料移液管一般配有一个合适的塞子，但在清洗干燥之后、灭菌之前需要将塞子塞进玻璃吸管。塞子能阻止洗耳球或移液控制器插进吸管造成的污染，还可以减少因不小心使移液管内容物进入控制器引起的交叉污染。如果塞子变湿，就将移液管丢弃。为无菌操作中的吸管加棉塞是一项十分烦琐的工作，清洗前去掉棉塞同样如此。目前有半自动吸管加塞机(参见图10.6)可用，它可加快操作进程，化繁为简，并用压缩空气吹掉旧塞子。在安装自动移液设备和重复移液器时，必须要小心避免污染(参见4.2.3节)。然而，快速分装可以减少疲劳，同时还可缩短培养皿与污染物接触的时间。

大容量移液

当培养器皿中的培养基超过100mL时，就要采用另一种方法转移液体。如果涉及的培养瓶较少，用一个100mL的移液管或刻度瓶，或者培养基袋就完全足够了。

但如果需要较大体积(≥500mL)的培养基或大批量的培养基，最好使用蠕动泵。

更大容量(10~10000L)的液体转移，一般通过在密闭式压力容器中，制备培养基的方法实现，接着通过高温高压蒸汽灭菌，然后通过正压将其转移至培养皿中。

也可以用灌注法分装大容量液体，但只能适用于预先测量样品的一次移液。

液体倾倒

任何时候都不要把液体，从一个无菌容器倒入另一个无菌容器，除非你倾倒的试剂瓶只用一次，而且是将全部内容物(预先测量过的)一次性倒入一个容器。

倾倒的主要危害是在试剂瓶内、外两侧之间形成了一个液体桥，在储存和培养过程中，有可能使污染物进入试剂瓶内。

标准化操作

良好的无菌技术的核心体现在许多标准的良好实验室规范准则上。保持一个干净明亮的工作空间，并且仅仅放置一次实验操作所需的物品或材料。

尽可能提前准备好，这样会缩短培养物在培养箱外的时间，使各种操作快速、轻松和顺利。

将台上所有一切都时刻保持在视线内， 时时警惕无菌表面和非无菌表面间的意外接触。

实验完毕后，要保持操作区干净整洁。

良好的无菌技术

生物安全柜内的无菌技术范例

概要

清洁和擦拭工作区，将瓶子、吸管和其他设备带进来。首先是做准备工作(培养基和其他 试剂的配制),然后进行细胞培养工作。结束后整理操作台并用70%乙醇擦拭台面。

材料

无菌(放入生物安全柜内)

培养基；移液管，带刻度的，带塞子的，按照1mL、5mL、10mL、25mL等不同规格，若是玻璃的，将玻璃移液管分类装在方形吸管筒中，进行干热灭菌或者高压蒸汽灭菌，若是塑料的，在外层包装纸内再将一次性塑料移液管进行单独包装(拆下外层包装，将移液管 放置灭菌筒内或吸管架上)； 培养瓶

非无菌

移液控制器或洗耳球，置于生物安全柜内

装有70%乙醇的喷壶，置于生物安全柜中

无绒棉球或抹布，置于生物安全柜旁

吸水纸巾，置于生物安全柜旁

带有水和消毒剂(参见6.8.5节)的移液管筒(参见6.8.6 节)或托架内双层厚度的高压生物灭菌袋废物袋，置于生 物安全柜旁地面上

废物筐(装废弃的纸、棉签和包装纸),放在生物安全 柜旁地面上，另一侧放置移液管筒或废物袋

吸液器的吸入管线(图4.9)或带盖的废液烧杯(图5.8) (均含消毒剂),分别置于生物安全柜内、安全柜下方

剪刀

耐乙醇的墨水记号笔

废液烧杯。过滤漏斗可防止 内容物从烧杯中溅出

操作步骤

1.用70%酒精棉球或消毒纸巾擦拭生物安全柜内的操作台面及所有柜内摆放的物品，还包括前面的玻璃屏风内侧面。

2.从冷室、水浴槽中取出培养基及所用试剂或者其他从冷冻箱内取出带溶解的物品，用乙醇擦拭试剂瓶，并将自己首先要用到的物品摆放到生物安全柜中。

3.将移液管放到生物安全柜后侧面并易于拿到的地方

4.打开移液管筒，将盖子放在顶部或斜在一侧，筒口朝下，或者将所有独立包装的塑料移液管按照规格归类放在架子上或管筒内。

5.整理好其他玻璃器皿、塑料制品及你所需要的仪器设备，将它们放在推车中或附近的工作台上。

6.拧松但不要移走所有要使用的培养瓶盖子。

7.打开自己将要用移液管移入溶液的培养瓶瓶盖，以及要从中吸取溶液的试剂瓶瓶盖。将瓶盖口朝上放到生物安全柜后部或试剂瓶的后面，保证手不会从其上方穿过。如果一次仅打开一个瓶盖，可以把盖子夹在小指和手掌之间的掌弯处(图5.7)。移液完成后，将盖子重新盖回原来的瓶子上。

8.选择移液管。

(a)如果选玻璃移液管：

(i)从盒中取移液管时，要保持待取移液管与其他移液管平行，尽量少碰及其他物件，特别是移液管滴头。# 如果待取的移液管碰触到了盒内其他移液管的底部，请丢弃它;

(ii)在移液管末端安入一个移液控制器或洗耳球，管口不要朝向自己。一定要握在刻度上端，这样可保证移液管进入试剂瓶或培养瓶的部分不会被污染。

(b)如果选独立包装的塑料移液管：

(i)从顶部打开移液管的包装；

(ii)剥开包装纸，使外皮卷向内面；

(iii)将移液管末端安上洗耳球或移液控制器；

(iv)从包装中取出移液管，保证不接触到包装外面部分或移液管碰到其他未灭菌物的表面;

(v)将包装纸丢进废物筐中。

安全提示将移液管插入洗耳球中或移液控制器时不要过分使劲，用力太大会导致移液管破裂

9.当插上洗耳球或移液控制器的移液管时，它们与手臂保持垂直的角度，注意移液管的头部不要碰及培养瓶的外部或生物安全柜内表面(参见图5.9圈定区域);时刻注意移液管的位置。当学习无菌操作技术时，这个过程并不容易，但它是成功实验的一个重要因素，多加练习则熟能生巧。

10.将含有培养基的培养瓶斜向手中拿的移液管，这样手便不会越过打开的瓶口，用移液管吸取5mL培养液并将其转移到一个培养瓶中。

11.把用过的吸管放入盛有消毒剂的移液管筒内。若是塑料移液管，则放入双层厚度的高压生物灭菌袋中。

12.将培养瓶重新盖上盖子。

13.将培养基液瓶和培养瓶的盖子盖上。在完成某一特定训练项目时，瓶口可以暂时敞开。但不论任何原因要离开生物安全柜时，一定要盖上瓶子盖子。

14.操作完成后，拧紧所有瓶盖，将培养瓶放入培养箱。

15.将不再需要的溶液和实验材料移走，并擦净工作台面。

16.如果用的是灭菌筒独立包装的塑料移液管，可以重新将灭菌筒盖上盖子，剩下的移液管可在下次实验时使用。而没有用过的玻璃移液管需要返回到准备区重新灭菌。

开放式工作台的操作

概要

清洁并擦拭工作区，准备好试剂瓶、培养瓶、移液管、其他器具和试剂(图5.6)。首先是做准备工作。将培养基从试剂瓶转移到培养瓶。必要时对相关器具灼烧消毒，保持工作台面干净整洁。最后整理台面，用70%乙醇擦拭工作台。

材料同上

操作步骤

1.用70%乙醇擦拭工作台面。

2.从冷室、水浴槽中取出培养基及所用试剂或者其他从冷冻箱内取出带溶解的物品，用乙醇擦拭试剂瓶，并将首先要用到的物品摆放到工作区的操作台上。其他物品放置一边。

3.在工作区安排如下操作，即将培养基从一个试剂瓶移到一个培养瓶内，操作要在靠近本生灯的台面上进行，此处的气流因对流原因向上流动。

4.将移液管放到工作台面一侧易于拿到的地方。(a)若是玻璃移液管，打开移液管筒，将盖子放在顶部或斜在一侧，筒口朝下。 (b)若是塑料移液管，拆掉外层包装，将里面独立包装的移液管按照规格归类放在架子上或管筒内。

5.整理好其他玻璃器皿、塑料制品及需要的器具，把它们放置在近旁。

6.在火焰中快速旋转灼烧瓶颈，并松开瓶盖。

7.选择移液管。

(a)如果是玻璃制品：

(i)从盒中取移液管时，要保持待取移液管与其他移液管平行，尽量少碰及其他物件，特别是移 液管滴头(如果待取的移液管碰触到了盒内其他移液管的底部，请丢弃它); (ii)在移液管末端安入一个移液控制器或洗耳球，管口不要朝向自己。一定要握在刻度上端，这样可保证移液管进入试剂瓶或培养瓶的部分不会被污染。

(b)如果是塑料制品：

(i)从顶部打开移液管的包装； (ii)剥开包装纸，使外皮卷向内面； (iii)将移液管末端安上洗耳球或移液控制器； (iv)从包装中取出移液管，保证不接触到包装外面部分或移液管碰到其他未灭菌物的表面; (v)将包装纸丢进废物筐中。

推动移液管(仅玻璃制品)纵向穿过火焰，旋转180°后再通过火焰返回。过程仅持续2~3s,否则会造成移液管过热。如果碰触到任何物件或者通过任何其他方式污染了移液管，请丢弃它，而不要试图通过灼烧再对移液管灭菌。勿对塑料移液管灼烧。

9.将移液管插入洗耳球或移液控制器中，管口不要朝向自己。手一定要握在刻度上端，这样移液管进入试剂瓶或培养瓶的部分不会被污染。

#安全提示将移液管插入洗耳球时不要用劲过大，否则移液管会破裂

10.当插上洗耳球或移液控制器的移液管时，它们与手臂保持垂直的角度，注意移液管的头部不要碰及培养瓶或移液管筒的外部；时刻注意移液管的位置。当学习无菌操作技术时，这个过程并不容易，但它是成功实验的一个重要因素，多加练习则熟能生巧。

11.不要让移液管管口朝向自己，将第一个试剂瓶的盖子夹在小指和手掌之间的掌弯处(图5.7)。当你用移液管转移液体到好几个培养瓶或试剂瓶中时，瓶子可以摞起平放。操作时让瓶子倾斜，这样你的手不会越过瓶颈口。如果手拿着瓶盖移液比较困难，就口朝下将盖子放到台面上。如果瓶子暂时不需要盖盖子时，应该将它们倾斜尽可能接近水平放置在台面上或瓶架上。应尽量靠近位于气流上升区的酒精灯处操作。

12.灼烧瓶颈。

13.将培养瓶斜向手中的移液管，这样手便不会越过打开的瓶口。

14.吸出所需要的液体量，并握紧移液管。

15.灼烧瓶颈，重新盖盖子。

16.丢弃接收瓶的瓶盖，灼烧瓶颈，添加液体，再灼烧瓶颈和瓶口，换用新瓶盖。

17.操作完成后，拧紧瓶盖。

18.将不再需要的溶液和实验材料从超净台移走，擦净工作台面。

19.如果移液管筒中装的是独立包装的塑料移液管，可以重新将移液管筒盖上盖子，到下次再用。没有用过的玻璃移液管则需要返回到准备区重新灭菌。

仪器和设备

在组织培养区的所有仪器设备均需定期清洁，以避免灰尘沉积和防止微生物在偶然溅出物上生长。替换物，如气瓶，在进入组织培养区前必须进行清洁处理。进行无菌操作过程中，不要让仪器设备有大的挪动。

冰箱和冷室

由于每次开门时潮湿的空气进入冷凝造成的潮湿环境，冰箱和冷藏室的墙壁会出现累积真菌污染的趋势。潮湿的空气增加了储藏的瓶子上面孢子沉积的风险，因此瓶子在放入通风橱前应该用乙醇擦拭(参见5.5节)。每隔几个月，冷藏库就应被清洁，墙壁和支架应该用消毒剂清洗。

恒温箱

污染的一个主要来源是湿式恒温箱(参见14.1.4节)。任何溢出物都要用灭菌抹布立即擦掉。恒温箱中的水要每周用灭菌反渗水(RO)或去离子水(不是超纯水)更换一次。恒湿箱要定期清理(根据空气污染情况和使用频率，每周一次或每月一次),移走包括所有架子、托盘等在内的物品，用Decon或RoccalD(Pfizer)等无毒去污剂彻底清洗恒温箱内部、架子和隔板，然后用70%乙醇洗去去污剂残迹。待乙醇完全挥发后，再把样品架和培养物放回去。若有可能，在每次清理恒温箱时，最好将支架、隔板和加湿托盘进行高压灭菌(见方案5.4)。

一些恒温箱可以利用高温高湿或紫外线提供灭菌程序。这样的程序或许在控制污染方面很有用，但往往意味着在灭菌过程中恒温箱有较长一段时间无法使用。而且，紫外线杀菌时，光线不能到达罅隙内。

清理频率一般与恒温箱所放位置有关；对于室内空气已被过滤的洁净区来说，每月一次已经足够了，但若实验室建在农村，正在进行工程建设或者翻新时清理间期则要缩短，因为此时的孢子数会增多。使用频率过高也会增加真菌污染的概率。但恒温箱正在使用时，任何溢出物都必须立即清除，并且被污染的培养物一旦被发现就要立即清除掉。

可以把杀真菌剂，如2%Rocall或1%硫酸铜放在培养箱底部的加湿托盘内，以阻止真菌生长。但这些杀真菌剂仅限于它们能接触到的表面，并不能真正代替定期清洗。一些培养箱有高温灭菌循环装置。一些风机循环式恒温箱有微孔过滤器和层流，可以阻止微生物的循环。但要接受的一点是，去掉风扇，依靠对流进行空气循环的恢复期，微生物数量会有一个略微增加(参见4.3.2节)。

参考资料

《动物细胞培养：基本技术和特殊应用指南（第七版）》

【相关资源】

名称：嗜黏蛋白阿克曼菌 | Akkermansia muciniphila

菌株编号：HZB366847, ATCC BAA-835, DSM 22959

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更新日期：2025-08-12

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